Oligonucleótidos en antisentido dirigidos a SMN2
Los ASOs son ácidos nucleicos monocatenarios sintetizados para ser complementarios a una secuencia de ARN diana. Una vez administrado, el ASO se introduce en la célula a través de un mecanismo endocítico aún poco definido y entra en el núcleo, donde se une a su ARNprevio diana.62 Inicialmente, los ASOs se utilizaban para suprimir la expresión génica, ya fuera bloqueando la traducción de un ARN diana o promoviendo su degradación. Hoy en día, los ASOs también pueden diseñarse para alterar el procesamiento o empalme de una diana. Los ASOs terapéuticos de SMA están diseñados para modificar el splicing alterativo del pre-ARNm de SMN2 de forma que el exón 7 se incluya en el transcrito procesado final. Como se ha discutido en capítulos anteriores, SMN2 se diferencia de SMN1 por una transición de C a T que ocurre seis nucleótidos en el exón 7 (hay otras diferencias entre las dos secuencias, pero ésta es la más importante funcionalmente). La transición de C a T crea un contexto inhibidor extendido en el exón 7 (también conocido como «Exinct»).63 Debido a que el exón 7 está débilmente definido debido a un débil sitio de empalme 5′, la mutación de C a T en SMN2 es suficiente para inclinar la balanza de su inclusión a la exclusión.
Los elementos reguladores del empalme juegan un papel importante en la determinación de qué sitios son reconocidos por la maquinaria de empalme celular. La localización y función de los elementos relevantes de SMN2 se identificaron mediante el análisis del efecto de splicing de una extensa serie de ASOs diseñados para complementar la secuencia de SMN2 de forma iterativa progresiva.63-El silenciador de empalme intrónico ISS-N1 se identificó como un elemento de silenciamiento muy potente a través de este método; el motivo se localiza aguas abajo del sitio de empalme 5′ del exón 7 y se une al represor de empalme hnRNP A1.66-68 Se han diseñado ASOs para inducir de forma fiable la inclusión del exón 7 apuntando a ISS-N1 u otros elementos reguladores.
Los ASOs pueden diseñarse para ser bifuncionales. Por ejemplo, se ha demostrado que los ASOs quiméricos que fusionan dominios de reclutamiento SR (péptido RS) con una secuencia antisentido que suprime los motivos silenciadores aumentan la inclusión del exón 7 y los niveles de proteína SMN en fibroblastos de pacientes; una única inyección del ASO bifuncional fue capaz de inducir la proteína SMN en el cerebro de ratones neonatos y dio lugar a una prolongación de la vida útil.65,69 Esta estrategia de diseño de ASO, conocida como ESSENCE (mejora del empalme específico de exón mediante pequeños efectores quiméricos), se aplicó inicialmente en la terapéutica de la AME, pero estudios posteriores demostraron que el péptido RS no era necesario para lograr un efecto sólido en la inclusión del exón 7 de SMN2. Dado que un enfoque quimérico introduce dificultades en la fabricación del ASO y limita la permeabilidad celular del ASO, los ASOs bifuncionales no han sido probados extensamente en ratones y actualmente no están siendo desarrollados clínicamente.62
Una vez que los ASOs dirigidos a ISS-N1 demostraron ser notablemente efectivos en la promoción de la inclusión del exón 7, la siguiente cuestión estratégica fue identificar qué columna vertebral del ASO sería mejor utilizada en una potencial terapia de la AME. Los oligonucleótidos que componen un ASO suelen modificarse para optimizar las propiedades farmacéuticas, como la captación celular, la toxicología, la farmacocinética y la unión a la diana. Una adaptación común, que surgió de una colaboración entre Ciba-Geigy Ltd. (ahora conocida como Novartis) (ahora conocida como Novartis) e Isis Pharmaceuticals (ahora conocida como Ionis Pharmaceuticals), es el 2′-O-metoxietilo (2′-MOE), que aumenta tanto la resistencia del ASO a la degradación por nucleasas como la afinidad de hibridación.70 Los oligonucleótidos 2′-MOE han demostrado ser muy seguros en roedores y primates, incluidos los humanos.62 La administración de un ASO de 2′-MOE que bloquea ISS-N1 aumentó con éxito el exón 7 de SMN2 de forma dependiente de la dosis y el tiempo en ratones con AME, mejorando la patología neuromuscular y aumentando drásticamente la supervivencia.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals, en colaboración con Biogen, está desarrollando una terapia de ASO de 2′-MOE llamada nusinersen (también conocida como IONIS-SMNRx y anteriormente llamada ISIS-SMNRx). Los estudios preclínicos de nusinersen en primates no humanos demostraron que una sola inyección intratecal podía dar lugar a las concentraciones tisulares necesarias para lograr mejoras significativas en la inclusión del exón 7 y que esas concentraciones se mantenían durante varios meses.62 La larga vida media del fármaco significa que los pacientes pueden necesitar solo una inyección intratecal cada pocos meses.73 En un estudio abierto de fase 1 en pacientes con AME tipo II/III de 2 a 14 años, una sola inyección de nusinersen fue bien tolerada y parece haberse correlacionado con un aumento de las puntuaciones de HFMSE en la dosis más alta.74 En junio de 2015, Ionis dio a conocer nuevos datos de un estudio abierto de fase 2 de nusinersen en bebés de tipo I, que demostró que los bebés vivían más tiempo y alcanzaban más hitos motrices de lo que se esperaría normalmente de la historia natural de la enfermedad.75 Además, el mecanismo de acción del fármaco se vio respaldado por datos que mostraban un aumento de la cantidad de ARNm de SMN2 de longitud completa y de la proteína SMN en los tejidos del cerebro y la médula espinal de las autopsias de los pacientes que recibieron el tratamiento. Ionis también dio a conocer los datos de su estudio de extensión abierto de fase 2 en niños con AME de tipo II/III, mostrando que el 57% de los sujetos lograron al menos una mejora de tres puntos en el HFMSE y una mejora media de 55 m en la prueba de marcha de 6 minutos (6MWT).76 Actualmente se están llevando a cabo estudios de fase 3 de nusinersen tanto en bebés como en adultos con AME (NCT02193074; NCT02292537); los resultados deberían estar disponibles en 2017.
Aunque todavía no se han observado problemas de seguridad con el uso de 2′-MOE en la terapia de la AME, se han asociado algunas toxicidades con los ASOs de 2′-MOE en otras poblaciones de pacientes.77,78 Otra modificación de la columna vertebral que se está explorando para su uso en la AME y que puede evitar estos problemas son los oligómeros morfolinos de fosforoamidato (PMO). Los PMOs han demostrado ser más efectivos que el 2′-MOE en modelos de ratón de distrofia muscular de Duchenne (DMD), otra enfermedad neuromuscular pediátrica, y también fueron bien tolerados en pacientes con DMD.79 Una inyección ICV de ASOs morfolinos complementarios a ISS-N1 mejoró significativamente la supervivencia de los ratones con AME sin signos de toxicidad en el sistema nervioso central (SNC).80,81 Un morfolino dirigido a ISS-E1, un silenciador de empalme intrónico que se encuentra aguas arriba del exón 7, también mejora el fenotipo de los ratones con AME.82 Este enfoque aún no se ha llevado a la clínica.
La química de la columna vertebral de un ASO puede afectar a la idoneidad de varios métodos de administración, la necesidad de repetir la dosis y conferir toxicidades asociadas, todo lo cual tiene importantes implicaciones para su uso terapéutico. Además, un ASO utilizado para tratar la AME debe permanecer farmacológicamente activo en los tejidos del SNC, especialmente en las neuronas motoras. Independientemente de la columna vertebral, cualquier ASO diseñado para la terapia de la AME probablemente tendrá que ser administrado directamente en el líquido cefalorraquídeo a través de una inyección intratecal. Aunque algunos estudios que utilizaron la administración periférica de ASO en ratones neonatos mostraron eficacia, la barrera hematoencefálica no está completamente formada en los ratones jóvenes y un ASO administrado periféricamente es capaz de penetrar en el SNC en un grado que no es posible en los seres humanos.71 De forma alentadora, se ha demostrado que los ASO inyectados intratecalmente se distribuyen ampliamente entre tejidos importantes del SNC como las neuronas motoras, los astrocitos y la microglía.72,83-85
Aunque la inyección intratecal es algo invasiva y requiere sedación o anestesia, los ASOs tienen varias ventajas significativas sobre otras modalidades experimentales, incluyendo una alta especificidad de la diana, una eficacia notable, poca toxicidad comparada con la administración sistémica de ASOs, y procesos de fabricación relativamente simples comparados con los biológicos (pero no con las moléculas pequeñas). Encontrará más información en el capítulo 18.