Analysis and description of the stages of Aspergillus fumigatus biofilm formation using scanning electron microscopy

Z medycznego punktu widzenia Aspergillus fumigatus jest oportunistycznym patogenem osób z obniżoną odpornością, z ciężkością choroby zależną od stanu odporności gospodarza, wykazującym śmiertelność na poziomie 50-95%. Grzyb ten jest przyczyną zakażeń miejscowych, takich jak grzybica paznokci lub grzybicze zapalenie rogówki, oraz zakażeń inwazyjnych, takich jak aspergiloza, i stanowi drugą co do częstości przyczynę zakażeń grzybiczych u pacjentów hospitalizowanych. Zakażenie A. fumigatus w drogach oddechowych może powodować grzybicę płuc, inwazyjną aspergilozę, inwazyjną aspergilozę płuc (IPA), zapalenie płuc z nadwrażliwości, astmę, alergiczny nieżyt nosa indukowany immunoglobuliną E, przewlekłe martwicze zapalenie płuc lub alergiczną aspergilozę oskrzelowo-płucną (ABPA). Ponadto jest przyczyną zapalenia kości i wsierdzia.

A. fumigatus tworzy biofilm, który może być jednym z najważniejszych czynników wirulencji. Biofilm A. fumigatus tworzy grzybnia osadzona w EMC in vitro, a tworzenie biofilmu opisano w komórkach nabłonka oskrzeli ludzkich (HBE) i komórkach nabłonka oskrzeli chorych na mukowiscydozę (CFBEC) oraz u pacjentów z mukowiscydozą. Tworzenie biofilmu grzybiczego na cewnikach i protezach przyczynia się do rozwoju zakażeń szpitalnych. Utrzymywanie się zakażeń grzybiczych wynika zatem ze zdolności grzyba do tworzenia biofilmów na wielu różnych wyrobach medycznych oraz z faktu, że przetrwalnikowe komórki stanowią ważny mechanizm oporności. Terapia poddana założonemu biofilmowi u gospodarza wymaga zwykle podania toksycznych stężeń środków przeciwdrobnoustrojowych, a zalecane leczenie obejmuje usunięcie skażonego wyrobu; jest to jednak proces trudny i kosztowny. Dlatego biofilmy grzybicze stanowią poważny problem kliniczny i ekonomiczny .

W ostatniej dekadzie opublikowano kilka badań dotyczących biofilmu A. fumigatus, zarówno in vivo (w modelach mysich, u pacjentów z inwazyjną aspergilozą płucną i w pierwotnych hodowlach ludzkiego nabłonka), jak i in vitro (na płytkach polistyrenowych). Ogólnie rzecz biorąc, badania te dotyczą głównie stadium dojrzałości biofilmu i składu chemicznego ECM, z niewielką ilością obrazów stadiów biofilmu, ale każde z nich opisywało wszystkie stadia tworzenia biofilmu. Tak więc, informacje są różne od wkładu dokonanego przez naszą grupę roboczą .

Najważniejsze wkłady tego badania są następujące: i) dostarczamy opis każdego etapu w tworzeniu biofilmu A. fumigatus in vitro, w czasie, a etapy są poparte obrazami SEM; ii) przeanalizowaliśmy dwa różne pochodzenia izolatów: jeden ze środowiska i jeden od pacjenta z wrzodem rogówki; iii) opisujemy mikro-hyphae (izolat kliniczny) i struktury grzybów, które były rzadko zgłaszane do tej pory i które nie zostały opisane, zgodnie z naszą wiedzą, dla gatunków Aspergillus; i iv) dostarczamy opis kroku dyspersji dla tworzenia kolonizacji biofilmu w nowych punktach.

Aby przeanalizować organizację strukturalną dojrzałego biofilmu A. fumigatus (24 h inkubacji w 28 °C i 37 °C), dwa szczepy, jeden z gleby i drugi od pacjenta z grzybiczym zapaleniem rogówki, zostały zbadane przez SEM. Podsumowując obserwowane w tym badaniu tworzenie biofilmów A. fumigatus, należy stwierdzić, że zachowywały się one podobnie, niezależnie od tego, czy izolat pochodził z gleby, czy z kliniki; różnice występowały jednak w zależności od temperatury inkubacji. W temperaturze 28°C, biofilm wykazywał etapy podobne do tych opisanych w klasycznym wzroście mikroorganizmów: fazę lag, wykładniczą i stacjonarną; wzrost biofilmu był powolny i stabilny z niską produkcją ECM, a organizacja strukturalna grzyba była prosta (Rys. 1). W temperaturze 37 °C krzywa wydajności wykazywała dość zmienną fazę lag (adaptacyjną) i log (wykładniczą), co może być odpowiedzią na stres spowodowany inkubacją w wysokiej temperaturze; tak więc w temperaturze 37 °C następuje redukcja fazy adaptacyjnej (lag) w celu utrzymania żywotności grzyba; również faza log, z nieciągłym wzrostem i z obydwoma zachowaniami jest prawdopodobnie odpowiedzią adaptacyjną. Tak więc, w 37 ° C podczas fazy dojrzewania, było niezwykle zorganizowane struktury mycelia, a te były zredukowane i zagęszczone z hyphae, które były pogrubione i połączone w anastomozie, a ECM był obfity w jego pokryciu, otaczając i wzmacniając struktury grzybów (Fig. 3 i 4).

W tym badaniu, dostarczamy dowodów na etapy biofilmu A. fumigatus przez SEM. Etapy obserwowane podczas tworzenia biofilmu były następujące:

Przyleganie, koagregacja komórek i produkcja EPS

Na wczesnym etapie (ryc. 2/4 h), konidia przylegają do powierzchni płytki poprzez oddziaływanie sił elektrostatycznych pomiędzy składnikami strukturalnymi ściany komórkowej grzyba, a ta siła przyciągania jest słaba i dlatego odwracalna. Nieodwracalne i trwałe wiązanie zostało szeroko opisane w specyficznych adhezynach bakteryjnych obecnych na powierzchni komórek, które wiążą się z podłożem oraz EPS, czyli substancjach produkowanych przez mikroorganizm w początkowych etapach tworzenia biofilmu, które pełnią funkcję adhezyjną komórek do siebie i do podłoża, a składają się z kompleksów białkowo-węglowodanowych i glikoprotein pełniących głównie funkcje strukturalne lub adhezyjne. Adhezyny biorą udział w rozpoznawaniu się komórek bakteryjnych między sobą, w tym w budowaniu mostów i inicjowaniu tworzenia kolonii. Adhezyny są opisane w adhezji grzybów podczas tworzenia biofilmu. W biofilmach Candida albicans, Candida glabrata i Candida tropicalis istnieje grupa genów adhezyjnych zaangażowanych w tworzenie biofilmu, należących do rodziny aglutynin-like sequence (ALS), która odgrywa kluczową rolę w tym procesie i koduje białka posiadające cechy glikoprotein adhezynowych na powierzchni komórek. Rodzina ALS występująca u C. albicans obejmuje osiem genów (ALS1-ALS7 i ALS9) kodujących wiele glikoprotein powierzchniowych. U A. fumigatus na powierzchni konidiów zidentyfikowano sześć hydrofobin, w skład których wchodzą pręciki RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp i RodFp. Ta hydrofobowa właściwość umożliwia adhezję do białek komórek gospodarza i mogą one być zaangażowane w przyleganie do powierzchni płytki polistyrenowej i inicjowanie procesu tworzenia biofilmu u wszystkich lub tylko u dwóch czy trzech z nich. Dodatkowo, Gravelat i współpracownicy opisali tę interakcję grzybów i stwierdzili, że adhezyna MedA kontroluje przyleganie do płytki polistyrenowej, tworzenie biofilmu i ekspresję genów konidiacji oraz że ma ona silny wpływ na proces konidiacji u A. fumigatus. Adhezja, wynikająca z interakcji pomiędzy adhezynami grzyba a powierzchnią płytki, oraz adhezja konidium-konidium prawdopodobnie uruchamia sygnalizację i promuje koagregację komórek oraz produkcję EPS, a zdarzenia te przedstawiono na ryc. 2 (4 h). W tym samym czasie EPS przyspiesza tworzenie kolonii grzybów poprzez ścisłe wiązanie komórek (Ryc. 2 (8-12 h)) .

Kiełkowanie konidiów do hyfusów i rozwój

Tworzenie biofilmu wymaga progowej liczby komórek, aby mogły być wyczuwane i generować odpowiedź, co jest mechanizmem regulacyjnym ekspresji genów o specyficznych funkcjach. W formowaniu biofilmu A. fumigatus, przed rozpoczęciem kiełkowania konidiów, powierzchnia konidiów jest wyraźnie hydrofobowa i składa się w 40% z hydrofobowych grup metylowych. W wyniku kiełkowania konidiów A. fumigatus dochodzi do przerwania hydrofobowej warstwy białkowo-rodnikowej i odsłonięcia wewnętrznych ścian konidiów, które składają się głównie z polisacharydów, będących hydrofilowymi składnikami ścian komórkowych. Na pojedynczym kiełkującym zarodniku znajduje się hydrofobowy wierzchołek. Konidium stopniowo traci swoją hydrofobowość powierzchniową, po czym w nowym punkcie wzrostu obserwuje się współistnienie hydrofobowych pręcików i hydrofilowych polisacharydów. Kiełkowanie konidiów do postaci hyfusów rozpoczyna się od formowania zarodków, jak pokazano na ryc. 2 (8-12 h), posiadających bardzo hydrofilną naturę ściany komórkowej, i oczekuje się, że będą one sprzyjać wzrostowi hyfusów .

Dojrzewanie biofilmu

Dojrzewanie biofilmu A. fumigatus obserwowano po 24 h, co jest czasem inkubacji podobnym do podawanego przez innych badaczy. Składniki strukturalne obejmują ECM, który jest obecny w dojrzałym biofilmie i wiąże komórki, tworząc podstawę strukturalną biofilmu, w tym EPS i wiele zorganizowanych mycelii (Ryc. 2 (24 h0) . ECM. Woda jest najobficiej występującym składnikiem i w biofilmie stanowi prawie 97%. W tym wilgotnym środowisku znajduje się uporządkowana sieć makrocząsteczek. Główne funkcje opisane dla EPS w biofilmach bakteryjnych są następujące: adhezja, agregacja komórek, kohezja; retencja wody, bariera ochronna jako specyficzne mechanizmy obronne gospodarza lub środki przeciwbakteryjne, absorpcja związków organicznych i jonów nieorganicznych, aktywność enzymatyczna, źródło składników odżywczych, wymiana informacji genetycznej, donor lub akceptor elektronów, eksport składników komórkowych, magazynowanie nadmiaru energii oraz stabilizacja enzymów. W biofilmach grzybowych wszystkie te funkcje nie są jeszcze opisane, ale niektóre z nich są badane: siły spójności i adhezji macierzy przyczyniają się do architektonicznej i mechanicznej stabilności biofilmu. Komórki grzybów s± unieruchomione w macierzy i działaj± jak funkcjonuj±cy ekosystem w ci±głych zmianach i homeostatycznej regulacji z intensywnymi interakcjami, wł±czaj±c w to komunikację komórka-komórka, która działa jak klej trzymaj±cy komórki razem. Struktura biofilmu jest bardzo zróżnicowana w zależności od wytwarzającego go mikroorganizmu i warunków panujących w jego mikrosiedlisku, w tym różnic strukturalnych związanych z obrazem klinicznym. Podczas procesów zakaźnych ECM wspomaga ochronę przed gospodarzem, jak również oporność drobnoustrojów na leki; ECM jest więc nie tylko mechanicznym szkieletem, ale również regulatorem zachowania komórek. Hydrofobowe białka macierzy wiążą się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórek, co powoduje adhezję komórka-matryca, która wywiera wpływ na kształt, migrację, proliferację, przeżycie i metabolizm komórek. Ponadto ECM chroni komórki przed szkodliwym działaniem środowiska, w tym wysychaniem, promieniowaniem ultrafioletowym (UV), radiacją, utlenianiem, głodzeniem, działaniem drapieżników i mechanizmów obronnych gospodarza oraz antybiotyków. Na ryc. 2 (24 h) i ryc. 3 widoczne są cechy ECM, która przylegała do strzępek grzyba tworząc przylegającą otoczkę, a także obserwowano porowatą konsystencję (ryc. 2 (24 h)). W biofilmie A. fumigatus EPS był wysoce strukturalnie uporządkowany i obficie produkowany, który pokrywał, otaczał i wzmacniał struktury grzybów; pełnił funkcję kohezyjną dla zlepiania struktur hyphae-hyphae (tylko 37 °C). EPS występuje w postaci śluzowatej, która przylega całkowicie i pokrywa strzępki, powodując zespolenie i zamykając światło kanałów wodnych (ryc. 2 (24 h), 3 i 4). W poprzednich badaniach nasza grupa robocza opisała etap dojrzewania biofilmu A. fumigatus, w którym obserwowano podobne struktury .

W niektórych mikrokonsorcjach skład chemiczny EPS jest znany (polimery węglowodanowe, DNA i / lub białka i, lipidy, między innymi), ale inne pozostają do zidentyfikowania. Powierzchnia A. fumigatus składa się z α-1,3-glukanów, chityny, chitozanu, galaktomannanu, galaktozaminogalaktanu, melaniny i białek. Skład i organizacja strukturalna ściany komórkowej ulega ciągłym przemianom; nawet jeśli obecne w niej polisacharydy są takie same, ich ilość i lokalizacja zmieniają się w zależności od warunków wzrostu i środowiska pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiono skład chemiczny biofilmu A. fumigatus, który zaobserwowano poprzez współlokalizację fluorochromów przyłączonych do chityny, aktywności metabolicznej i kwasów nukleinowych za pomocą CLSM; ponadto zaobserwowano nakładanie się sygnałów fluorochromowych w przypadku przyłączenia dwóch lub trzech z nich (ryc. 5). Opisana funkcja polisacharydów, takich jak α 1,3-glukany, polegała na odgrywaniu przez nie dominującej roli in vitro w agregacji hyfusów oraz w agregacji hyfusów w biofilmach. Inne polisacharydy ECM, w tym galaktomannan i galaktozaminogalaktan, są również znane z roli w ochronie grzyba oraz w przyleganiu jego struktur biofilmowych do powierzchni. Pozakomórkowe DNA (eDNA) jest ważnym składnikiem ECM biofilmu, który utrzymuje strukturalną i architektoniczną integralność A. fumigatus. eDNA powstaje w wyniku autolizy i zostało istotnie powiązane z poziomem oporności przeciwgrzybiczej (ryc. 5). Ponadto, eDNA może być rezerwuarem genów dla horyzontalnego transferu genów. eDNA pochodzi z komórek grzybów, ponieważ A. fumigatus wydziela chitynazy, które sprzyjają jego uwalnianiu (ryc. 5). W biofilmie modyfikacja ściany komórkowej wywiera zasadniczy wpływ na oporność na leki działające na ścianę komórkową. U A. fumigatus, w mysim modelu biofilmu, w wielolekoopornych (MDR) pompach efflux AfuMDR4, gen związany z wydalaniem środków przeciwdrobnoustrojowych, był znacząco indukowany przez leczenie worykonazolem po 24 h . Marker FUN1 ujawnił aktywność metaboliczną, która jest żywą społecznością (ryc. 5).

Mycelia: Biofilm wykazuje złożoną trójwymiarową (3-D) strukturę, która odzwierciedla skoordynowany proces komórkowy; widoczny był rozwój i ekspansja grzybni, która obejmowała zagęszczone sieci hyfalno-warstwowe, adhezję hyfusów, anastomozę w obu temperaturach, z optymalnym ułożeniem przestrzenno-formującym kanały zapewniające napływ substancji odżywczych i odpływ produktów odpadowych, a tym samym stabilizujące biofilm; w 37 °C kanał ten był bardziej widoczny (Fig. 2 (24 h), 3, i 4). Ponadto, struktury te były obserwowane przez innych badaczy. Microhyphae: We wczesnych etapach dojrzewania biofilmu, w izolacie klinicznym obserwowano nieregularne struktury grzybicze, takie jak mikrohyphae (ryc. 4). Fakt ten jest o tyle istotny, że w literaturze niewiele jest wzmianek o mikrohyphae i po raz pierwszy zostały one opisane u A. fumigatus. Mikrofazy wykazują zmiany cytoszkieletu, które powodują powstawanie krótkich i smukłych hyfusów o cienkich ścianach i zagiętych końcach. Mikrofazy są związane z wysoką aktywnością enzymatyczną, która sprzyja procesowi dojrzewania i następującej po nim dyspersji komórek w stadium biofilmu .

Dyspersja komórek

Podczas dyspersji komórek część biofilmu jest odrywana, część ta obejmuje konidia lub strzępki. Zaobserwowano asynchroniczny rozwój biofilmu, zwłaszcza na etapie dojrzewania biofilmu, gdy nowe konidia były zdolne do kiełkowania, wytwarzania nowych rozrostów grzybni i modyfikacji hyfusów, takich jak kędzierzawość (ryc. 4 i 6). Rozproszenie komórek biofilmu następuje w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Ma to na celu usunięcie niebezpiecznej substancji z głównej części biofilmu. Proces ten prowadzi do rozprzestrzeniania się i propagacji zasiedlających biofilm komórek w nowym miejscu, czemu sprzyjają złożone zdarzenia molekularne. Biofilmy mogą być postrzegane jako powłoki ochronne żywych komórek znajdujących się pod nimi, o niezwykle złożonych i niezliczonych funkcjach, a więc są to naprawdę niezwykłe konstrukcje biologiczne. Biofilmy zapewniają ochronę przed drapieżnikami lub atakiem chemicznym, a także dostarczają komórkom wewnętrznym medium do komunikacji wewnątrzkomórkowej, przepływu substancji odżywczych i transferu materiału genetycznego. Dyspersja komórek powoduje rozprzestrzenianie się zdolnych do życia komórek do innych miejsc w środowisku lub w obrębie gospodarza, gdzie mogą się one rozmnażać, ułatwiając w ten sposób jego przetrwanie. Rozproszenie komórek następuje w wyniku niedoboru składników odżywczych w środowisku, a więc jest to mechanizm przetrwania. Dlatego rozproszenie komórek jest ważne nie tylko dla promowania różnorodności genetycznej, ale także dla ucieczki z niekorzystnych siedlisk, pomagając w rozwoju nowych nisz i utrzymaniu się mikroorganizmu w nowym miejscu .