Mikroskopia jest dziedziną techniki wykorzystującą mikroskopy (instrument powiększający) do oglądania obiektów i obszarów obiektów, które nie mogą być widziane gołym okiem (obiekty, które nie są w zakresie rozdzielczości normalnego oka).17 Mikroskop jest urządzeniem, które wykorzystuje soczewkę lub system soczewek do wytwarzania znacznie powiększonego obrazu obiektu. Nowoczesna mikroskopia wykorzystuje obecnie oprogramowanie takie jak ImageJ, CellProfiler, NeuronStodio do pozyskiwania i analizy obrazów.1
Istnieją dwie gałęzie mikroskopii.1,18
- Mikroskop świetlny (mikroskop prosty, mikroskop złożony, mikroskop rozcinający (mikroskop stereoskopowy), mikroskop porównawczy, mikroskop odwrócony, mikroskop chirurgiczny i cyfrowy.
- Mikroskop elektronowy (transmisyjny i skaningowy mikroskop elektronowy)
Mikroskop świetlny
Odnosi się to również do mikroskopu optycznego, jest to rodzaj mikroskopu, który wykorzystuje światło widzialne i system soczewek do powiększania obrazów małych próbek.17 Mikroskopy optyczne są najstarszą konstrukcją mikroskopu i prawdopodobnie zostały wynalezione w ich obecnej, złożonej formie w XVII wieku. Podstawowe mikroskopy optyczne mogą być bardzo proste, chociaż istnieje wiele złożonych konstrukcji, które mają na celu poprawę rozdzielczości i kontrastu próbki, takich jak mikroskopy złożone, rozcinające i chirurgiczne.19 Nowoczesne mikroskopy pozwalają na więcej niż tylko obserwację obrazu próbki w świetle przechodzącym; istnieje wiele technik, które mogą być wykorzystane do uzyskania innych rodzajów danych. Większość z nich wymaga dodatkowego sprzętu oprócz podstawowego mikroskopu złożonego.17 Mikroskopia optyczna jest szeroko stosowana w histologii, histopatologii, mikroelektronice, nanofizyce, biotechnologii, badaniach farmaceutycznych, mineralogii i mikrobiologii.20
Mikroskop prosty: Mikroskop prosty wykorzystuje soczewkę lub zestaw soczewek do powiększenia obiektu poprzez samo powiększenie kątowe, dając widzowi powiększony obraz wirtualny.21 Zastosowanie pojedynczej soczewki wypukłej lub grup soczewek jest nadal spotykane w prostych urządzeniach powiększających, takich jak szkło powiększające, lupy i okulary do teleskopów i mikroskopów.22
Mikroskop złożony: Mikroskop złożony używa soczewki (obiektywu) blisko oglądanego obiektu do zbierania światła, które skupia rzeczywisty obraz obiektu wewnątrz mikroskopu. Obraz ten jest następnie powiększany przez drugą soczewkę lub grupę soczewek (zwaną okularem), która daje widzowi powiększony, odwrócony wirtualny obraz obiektu.18 Zastosowanie złożonej kombinacji obiektywu i okularu pozwala na znacznie większe powiększenie (do 1000-2000 razy) (Rysunek 7). Mikroskop złożony umożliwia również bardziej zaawansowane konfiguracje oświetlenia, takie jak kontrast fazowy.21,22
Rysunek 7 Zdjęcie mikroskopu złożonego.23
Mikroskop stereoskopowy: Mikroskop stereoskopowy jest mikroskopem o małej mocy, który zapewnia stereoskopowy widok próbki (do powiększenia 100 razy), powszechnie używany do dysekcji (Rysunek 8).18
Rysunek 8 Zdjęcie mikroskopu stereoskopowego.24
Mikroskop odwrócony: do badania próbek od dołu; przydatny do hodowli komórek w płynie lub do metalografii (Rysunek 9).18
Rysunek 9 Zdjęcie mikroskopu odwróconego.25
Mikroskop porównawczy: Jest to urządzenie służące do analizy okazów obok siebie. Składa się z dwóch mikroskopów połączonych mostkiem optycznym, dzięki czemu uzyskuje się podzielone okno widokowe umożliwiające jednoczesne oglądanie dwóch oddzielnych obiektów. Posiada dwie oddzielne ścieżki światła, co pozwala na bezpośrednie porównanie dwóch próbek poprzez jeden obraz w każdym oku (Rysunek 10). Dzięki temu obserwator nie musi polegać na pamięci podczas porównywania dwóch obiektów pod konwencjonalnym mikroskopem.27
Rysunek 10 Fotografia mikroskopu porównawczego.26
Mikroskop cyfrowy: Jest to odmiana tradycyjnego mikroskopu optycznego, która wykorzystuje optykę i kamerę cyfrową do wyprowadzania obrazu na monitor, czasami za pomocą oprogramowania działającego na komputerze.20 Mikroskop cyfrowy często posiada własne wbudowane źródło światła LED i różni się od mikroskopu optycznego tym, że nie ma możliwości obserwacji próbki bezpośrednio przez okular. Ponieważ obraz jest skupiony na układzie cyfrowym, cały system jest zaprojektowany dla obrazu z monitora (Rysunek 11). Pominięto okular dla ludzkiego oka.20
Rysunek 11 Zdjęcie mikroskopu cyfrowego.28
Mikroskop chirurgiczny: Służą do zwiększenia powiększenia chirurga (do 4-40 razy) podczas zabiegów chirurgicznych.29 Pierwotnie były stosowane w chirurgii ucha, nosa i gardła. Jednak nadal wyznaczają nowe standardy w chirurgii ogólnej, okulistyce, chirurgii ortopedycznej, chirurgii ginekologicznej, otolaryngologii, neurochirurgii, chirurgii jamy ustnej i szczękowej, chirurgii plastycznej, chirurgii podiatrycznej i chirurgii dziecięcej (Ryc. 6).29
Mikroskop elektronowy
Główna konstrukcja mikroskopu elektronowego jest podobna do mikroskopu świetlnego. Światło jest zastąpione elektronami, szklane soczewki są zastąpione soczewkami elektromagnetycznymi i elektrostatycznymi. Istnieją dwa główne typy mikroskopów elektronowych: transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) i skaningowy mikroskop elektronowy (SEM), z których TEM jest najczęściej używany (Rysunek 12).22 Największą zaletą jest to, że mają one wyższą rozdzielczość niż mikroskop świetlny, a zatem są również w stanie uzyskać większe powiększenie (do 2 milionów razy).31 Mikroskopy elektronowe pozwalają na wizualizację struktur, które normalnie nie byłyby widoczne w mikroskopie optycznym.32 Mikroskopy elektronowe są używane do badania ultrastruktury szerokiej gamy próbek biologicznych i nieorganicznych, w tym mikroorganizmów, komórek, dużych cząsteczek, próbek biopsyjnych, metali i kryształów (Rysunek 13).31 Nowoczesne mikroskopy elektronowe wytwarzają mikrografy elektronowe przy użyciu specjalistycznych kamer cyfrowych i frame grabberów do przechwytywania obrazu.
Rysunek 12 Zdjęcie obrazu z mikroskopu elektronowego.30
Rysunek 13 Zdjęcie tkanki kostnej w mikroskopie elektronowym, ukazujące kanał harwera (H) i Lacuna (L).37
Przekaźnikowy mikroskop elektronowy (TEM)
Przekaźnikowa mikroskopia elektronowa jest techniką opracowaną w celu uzyskania powiększenia, a tym samym szczegółów próbki, na znacznie lepszym poziomie niż w przypadku konwencjonalnych mikroskopów optycznych.34,35 W TEM wiązka elektronów przepuszczana jest przez ultracienką próbkę, oddziałując z nią podczas przechodzenia. Obraz powstaje w wyniku interakcji elektronów przepuszczanych przez próbkę; obraz jest powiększany i ogniskowany na urządzeniu obrazującym, takim jak ekran fluorescencyjny, na warstwie filmu fotograficznego lub wykrywany przez czujnik, taki jak kamera CCD.2 W TEM, elektrony przenikają przez cienką próbkę, a następnie są obrazowane przez odpowiednie soczewki, w szerokiej analogii do biologicznego mikroskopu świetlnego.22 TEM składa się z: systemu oświetleniowego, stolika z próbką, systemu obrazowania i systemu próżniowego. Elektronowa mikroskopia transmisyjna jest jedną z głównych metod analitycznych w naukach fizycznych, chemicznych i biologicznych. TEM znajduje zastosowanie w badaniach nad rakiem, wirusologią i materiałoznawstwem, jak również w badaniach nad zanieczyszczeniami, nanotechnologią i półprzewodnikami.36
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)
Skaningowy mikroskop elektronowy, ma podobną strukturę do TEM, ale kolumna jest znacznie krótsza, ponieważ jedyne potrzebne soczewki to te znajdujące się nad próbką, służące do ogniskowania elektronów w precyzyjnym punkcie na powierzchni próbki.37 Nie ma soczewek pod próbką. Z drugiej strony, komora próbki jest większa, ponieważ technika SEM nie nakłada żadnych ograniczeń na wielkość próbki, poza tymi, które wynikają z wielkości komory próbki.38 SEM tworzy obrazy próbki poprzez skanowanie jej powierzchni zogniskowaną wiązką elektronów. Elektrony oddziałują z atomami w próbce, wytwarzając różne sygnały, które zawierają informacje o topografii powierzchni próbki i jej składzie.39 Wiązka elektronów jest skanowana w rastrowym wzorze skanowania, a położenie wiązki jest łączone z wykrytym sygnałem w celu uzyskania obrazu. SEM może osiągnąć rozdzielczość lepszą niż 1 nanometr.40
Ultrasonografia
Ultrasonografia jest również określana jako badanie dopplerowskie lub badanie ultrasonograficzne stosowane w diagnostyce medycznej, jest to bezbolesna i nieinwazyjna technika, która wykorzystuje aparat ultradźwiękowy z cichymi falami dźwiękowymi o wysokiej częstotliwości (1 do 5 megaherców) do wytwarzania żywych obrazów wewnętrznych struktur ciała, znanych również jako sonogram. Umożliwia on lekarzom uwidocznienie chorych lub prawidłowych narządów lub tkanek (takich jak pęcherz moczowy, macica, nerki i jajniki) wewnątrz ciała bez konieczności wykonywania nacięcia. Skanowanie ultradźwiękowe jest zalecaną techniką medyczną do wizualizacji płodu u kobiet w ciąży/zwierząt, ponieważ nie wytwarza promieniowania jak inne techniki obrazowania medycznego.2
Technika ultradźwiękowa polega na użyciu płynnego żelu i ręcznej sondy przetwornika na powierzchni ciała. Sonda, która zawiera przetwornik akustyczny wysyła i odbiera miliony impulsów i echa do ciała na sekundę. Fale dźwiękowe przenikają do ciała i trafiają na granicę między tkankami (np. tkanką miękką i kostną), fale są odbijane z powrotem do sondy przetwornika, a następnie przekazywane do centralnej jednostki przetwarzającej (CPU) (rysunek 14-16). CPU jest maszyną, która dostarcza energię elektryczną do przetwornika, oblicza czas odbicia fali i głębokość interfejsu tkanek, które wywołują falę, tak aby skonstruować dwuwymiarowy obraz na monitorze. Procedura trwa zwykle co najmniej 30 minut.41,42
Ryc. 14 Zdjęcie aparatu ultrasonograficznego.41
Ryc. 15 Zdjęcie przepukliny wewnątrzmosznowej.41
Ryc. 16 Zdjęcie obrazu ultrasonograficznego przepukliny mosznowej.41
Poniżej przedstawiono różne rodzaje obrazów ultrasonograficznych
2D Obraz ultrasonograficzny: Jest to najczęstszy typ obrazu ultrasonograficznego, jest to seria płaskich, dwuwymiarowych obrazów przekrojów skanowanej tkanki. Ten sposób skanowania jest nadal standardem w wielu sytuacjach diagnostycznych i położniczych po pół wieku stosowania.43-46
3D Obraz ultrasonograficzny: Jest to obraz trójwymiarowy (3D), uzyskany z przekrojów tkanek skanowanych pod kilkoma kątami, a otrzymane dane są rekonstruowane w obraz trójwymiarowy. Ten USG jest powszechnie stosowany w celu zapewnienia bardziej kompletny i realistyczny sonogram (obraz) płodu oraz w diagnostyce rozszczepu wargi.44-47
4D Obraz ultrasonograficzny: wykorzystuje falę dźwiękową do produkcji wideo na żywo płodu w macicy.43-46 USG 3D i 4D produkuje realistyczne obrazy poruszającego się lub rozwijającego się płodu w macicy, które nie mogą być łatwo widoczne w obrazie USG 2D.43-46
Obraz USG Dopplera: Technika ta polega na wykorzystaniu odbitych fal dźwiękowych do ujawnienia wzoru i sposobu przepływu krwi w obrębie naczynia krwionośnego, czego nie można zobaczyć w obrazie ultrasonograficznym 2D, 3D i 4D. USG Doppler może być stosowane w diagnostyce wielu nieprawidłowości serca i naczyń krwionośnych, takich jak niewydolność żylna, zwężenie tętnic, zakrzepy, tętniaki i wrodzone choroby serca. Podczas badania USG Doppler głowica jest przesuwana nad skórą wzdłuż naczyń krwionośnych w celu wysyłania i odbijania fal dźwiękowych, fale dźwiękowe o wysokiej częstotliwości odbijają się od krążących komórek krwi, co w zamian zmienia częstotliwość odbitych fal, co określa się jako efekt Dopplera, a przy braku przepływu krwi zmiany nie zachodzą w odbitych falach dźwiękowych. Dane z odbitych fal dźwiękowych z efektem Dopplera są wykorzystywane do skonstruowania wykresu przedstawiającego wzór i sposób przepływu krwi przez naczynia krwionośne w procesorze. Istnieją trzy rodzaje ultrasonografii dopplerowskiej, a mianowicie: Doppler kolorowy, Doppler spektralny i Doppler mocy.43-46
Doppler kolorowy: Ten rodzaj ultrasonografii wykorzystuje tradycyjną ultrasonografię 2D do tworzenia obrazu naczynia krwionośnego i wykorzystuje komputer do zmiany dopplerowskich fal dźwiękowych na kolory, które reprezentują kierunek i prędkość przepływu krwi na obrazie naczynia krwionośnego.43-46
Doppler mocy: Jest to bardziej czuły rodzaj kolorowego Dopplera, który jest używany do generowania szczegółów przepływu krwi w organach stałych, które nie mogą być wizualizowane przy użyciu konwencjonalnego kolorowego Dopplera. Nie jest jednak możliwe obejrzenie kierunku przepływu krwi przy użyciu ultrasonografii power Doppler. 43-46
Spectra doppler: Jest to rodzaj ultrasonografii, która wykorzystuje wykres do przedstawienia przepływu i kierunku krwi. Jest w stanie wykazać stopień zablokowania naczynia krwionośnego.43,45
Doppler fali ciągłej: Ten rodzaj ultradźwięków wykorzystuje fale dźwiękowe, które są wysyłane i odbijane w sposób ciągły. Ten rodzaj fal dźwiękowych jest wykorzystywany do wykrywania zatorów w naczyniach krwionośnych i dokładnego pomiaru szybko płynącej krwi.43-46
Radiografia
Jest to najstarsza i najczęściej stosowana technika obrazowania diagnostycznego.3 Jest to technika nieinwazyjna, podobnie jak ultrasonografia, jednak wykorzystuje bardzo małą ilość promieniowania jonizującego lub niejonizującego (promieniowanie rentgenowskie) generowanego przez aparat rentgenowski w celu uzyskania utajonego obrazu wewnętrznych struktur ciała na kliszy rentgenowskiej (radiografia projekcyjna). Aparat rentgenowski może być stacjonarny, mobilny lub przenośny (ryc. 17-19).48-51 Podczas badania radiograficznego promieniowanie rentgenowskie jest kierowane na ciało i przechodzi przez narząd docelowy, a następnie jest rejestrowane na płaskiej kliszy rentgenowskiej w celu uzyskania obrazu dwuwymiarowego (ryc. 20). Badanie rentgenowskie może być wykonane z użyciem środka kontrastowego (takiego jak bar lub jod) lub bez niego, w zależności od gęstości badanego narządu. Radiografia może być wykorzystywana w diagnostyce wielu schorzeń, takich jak złamania kości, rak, guz piersi i gruźlica.48 Z nadmierną ekspozycją na promieniowanie rentgenowskie wiążą się pewne zagrożenia, takie jak rak, wypadanie włosów i oparzenia skóry. Jednak w większości przypadków korzyści przewyższają ryzyko.3,52
Rysunek 17 Zdjęcie stacjonarnego aparatu rentgenowskiego.3
Rysunek 18 Zdjęcie mobilnego aparatu rentgenowskiego.48
Rysunek 19 Zdjęcie przenośnego aparatu rentgenowskiego.48
Rysunek 20 Zdjęcie radiologiczne złamania śródręcza.3
Tomografia komputerowa (CT)
Tomografia komputerowa jest rodzajem radiografii, w której również wykorzystuje się promieniowanie rentgenowskie, w przeciwieństwie do radiografii projekcyjnej w tomografii komputerowej wykorzystuje się większą ilość promieniowania rentgenowskiego i uzyskuje się bardziej szczegółowy obraz trójwymiarowy, jednak w ostatnich latach niektóre tomografy komputerowe opracowano tak, aby wykorzystywały mniejszą ilość promieniowania rentgenowskiego. Aparat do tomografii komputerowej składa się z tomografu w kształcie pączka, stołu, lampy rentgenowskiej, detektora promieniowania rentgenowskiego i komputera (ryc. 21).54,55 Pacjent leży na stole przed wsunięciem się do tomografu, lampa rentgenowska i kamera poruszają się wokół pacjenta pod kątem 360° w celu zeskanowania i uzyskania wielokrotnego obrazu narządów wewnętrznych ciała, w zależności od interesującego nas narządu można podać materiał kontrastowy przez usta, odbyt lub wstrzyknąć go do żyły, aby uwypuklić skanowany narząd.55 Badanie wykonywane jest w oddzielnym pomieszczeniu komputerowym, gdzie obrazy są wyświetlane, a technolog komunikuje się z pacjentem za pomocą głośników i mikrofonów.56 Główną zaletą tomografii komputerowej jest szybkie uzyskanie wyraźniejszych obrazów diagnostycznych większej części ciała.56,57
Ryc. 21 Zdjęcie lwa poddawanego badaniu tomograficznemu.53
Istnieją specjalistyczne weterynaryjne tomografy komputerowe, takie jak ładowalny weterynaryjny tomograf komputerowy, który jest wyposażony w komorę rentgenowską umożliwiającą lekarzowi weterynarii pozostanie blisko zwierzęcia podczas skanowania, w związku z czym nie jest wymagane oddzielne pomieszczenie, jak w przypadku konwencjonalnej tomografii komputerowej u ludzi (ryc. 22).57 Podczas skanowania zwierzę będzie znieczulone i monitorowane, umieszczone i podtrzymywane na ruchomym stole przed wsunięciem do tomografu komputerowego (Rysunek 23).60,61
Ryc. 22 Zdjęcie ładowalnego weterynaryjnego tomografu komputerowego dla małych zwierząt.58
Rysunek 23 Tomografia komputerowa górnej części jamy brzusznej ukazująca liczne przerzuty w wątrobie u pacjenta z rakiem jelita grubego (czarna strzałka).59
Rezonans magnetyczny (MRI)
Rezonans magnetyczny (MRI) jest bezbolesną, nieinwazyjną techniką obrazowania diagnostycznego, która wykorzystuje silne pola magnetyczne i fale radiowe do tworzenia trójwymiarowego obrazu narządów wewnętrznych ciała. MRI nie wiąże się z promieniowaniem, jak to ma miejsce w radiografii (radiografia pociskowa, tomografia komputerowa i skanowanie PET).4 Urządzenie MRI wygląda podobnie jak tomografia komputerowa i PET, chociaż technika ta wymaga więcej czasu i powoduje głośniejszy hałas (ryc. 24).5,61,63
Ryc. 24 Zdjęcie skanera MRI.62
Podczas skanu pacjent (z lub bez środka kontrastowego) leży na stole, który wsuwa się do rury zawierającej duży magnes, który wytwarza pole magnetyczne i fale radiowe wokół ciała pacjenta, co pozwala tkankom ciała drgać. Drgania te są przekształcane w szczegółowy obraz na komputerze (rysunek 25).5
Rysunek 25 Obraz rezonansu magnetycznego mózgu.5
Pozytonowa tomografia emisyjna (PET)
PET jest techniką obrazowania funkcjonalnego 3D, w przeciwieństwie do tomografii komputerowej i promieniowania rentgenowskiego, demonstruje czynności fizjologiczne tkanek i narządów ciała za pomocą radiotraktometru (18F-FDG). Droga podania (doustna, żylna lub donosowa) radiotraktantu zależy od tkanki lub narządu będącego przedmiotem zainteresowania.64 Wstrzyknięty radiotraktant koncentruje się w tkance, która jest wyświetlana na komputerze jako obraz 3D. Maszyna jest podobna do CT i MRI, a nowoczesne obrazy ze skanowania PET można łączyć ze skanami CT lub MRI w celu uzyskania niepowtarzalnego widoku (ryc. 26).66
Ryc. 26 Zdjęcie maszyny PET.65
Skanowanie PET jest stosowane głównie w badaniach i diagnostyce guzów oraz zaburzeń związanych z mózgiem i sercem. Technika ta jest również bezbolesna i nieinwazyjna, jednak nie jest zalecana dla kobiet w ciąży, matek karmiących ze względu na promieniowanie emitowane przez radioterapeutyk 18F-fluoro-2-deoksyglukozę (18F-FDG) (Tabela 1). Obraz skanu PET jest kolorowy i przedstawia najbardziej aktywne obszary narządu lub tkanki, w zależności od ilości pochłoniętego przez nie radiotraktera (Ryc. 27).5,68-70
Ryc. 27 Skan mózgu z obrazem PET.67
Techniki obrazowania |
Maszyny/urządzenia |
Fotografia |
Kamera filmowa |
Kamera cyfrowa |
|
Mikroskopia |
Mikroskop świetlny: Mikroskop prosty, Mikroskop złożony, Mikroskop stereoskopowy, Mikroskop cyfrowy i Mikroskop chirurgiczny |
Mikroskop elektronowy: Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) i skaningowy mikroskop elektronowy (SEM) |
|
Ultrasonograf |
2D Ultrasonograf |
3D Ultrasound |
|
4D Ultrasound |
|
Doppler USG: Color Doppler, Power DOPPLER, |
|
Tomografia komputerowa (CT) |
Tomograf komputerowy dla ludzi |
Tomograf komputerowy dla weterynarii |
|
Resonans magnetyczny (MRI) skan |
Skaner MRI |
Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) skan |
Skaner PET |
Tabela 1 Zestawienie technik obrazowania
.