Antisense Oligonucleotides Targeted to SMN2
ASO są jednoniciowymi kwasami nukleinowymi syntetyzowanymi jako komplementarne do docelowej sekwencji RNA. Po podaniu, ASO są pobierane do komórki przez słabo jeszcze zdefiniowany mechanizm endocytarny, a następnie dostają się do jądra, gdzie wiążą się z docelowym pre-mRNA.62 Początkowo ASO były stosowane do hamowania ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego RNA lub promowanie jego degradacji. Obecnie ASO mogą być również zaprojektowane tak, aby zmieniać przetwarzanie lub splicing celu. ASO przeznaczone do terapii SMA są zaprojektowane tak, aby modyfikować splicing pre-mRNA SMN2, tak aby ekson 7 został włączony do końcowego przetworzonego transkryptu. Jak omówiono we wcześniejszych rozdziałach, SMN2 różni się od SMN1 przejściem C do T, które występuje sześć nukleotydów w eksonie 7 (istnieją inne różnice między tymi dwiema sekwencjami, ale ta jest najważniejsza z funkcjonalnego punktu widzenia). Przejście C do T tworzy rozszerzony kontekst hamujący w eksonie 7 (znany również jako „Exinct”).63 Ponieważ ekson 7 jest w innych przypadkach słabo zdefiniowany z powodu słabego miejsca 5′-splice, mutacja C do T w SMN2 jest wystarczająca, aby przechylić szalę z jego włączenia do wyłączenia.
Elementy regulacyjne splicingu odgrywają ważną rolę w określaniu, które miejsca są rozpoznawane przez komórkową maszynerię splicingu. Lokalizacja i funkcja odpowiednich elementów SMN2 zostały zidentyfikowane dzięki analizie efektu splicingowego obszernej serii ASO zaprojektowanych w celu uzupełnienia sekwencji SMN2 w postępujący iteracyjny sposób.63-Za pomocą tej metody zidentyfikowano intronowy tłumik splicingu ISS-N1 jako bardzo silny element wyciszający; motyw ten znajduje się poniżej miejsca splicingu 5′ eksonu 7 i wiąże się z represorem splicingu hnRNP A1.66-68 ASO zostały zaprojektowane tak, aby niezawodnie indukować inkluzję eksonu 7 poprzez ukierunkowanie na ISS-N1 lub inne elementy regulacyjne.
ASO mogą być zaprojektowane jako dwufunkcyjne. Na przykład, chimeryczne ASO, które łączą domeny rekrutacyjne SR (peptyd RS) z sekwencją antysensowną, która tłumi motywy wyciszające, zwiększają inkluzję eksonu 7 i poziom białka SMN w fibroblastach pacjentów; pojedyncza iniekcja dwufunkcyjnego ASO była w stanie indukować białko SMN w mózgu nowonarodzonych myszy i powodowała wydłużenie życia.65,69 Ta strategia projektowania ASO, znana jako ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), była początkowo stosowana w terapiach SMA, ale późniejsze badania wykazały, że peptyd RS nie był konieczny do osiągnięcia silnego efektu włączenia eksonu 7 SMN2. Ponieważ podejście chimeryczne wprowadza trudności w produkcji ASO i ogranicza przenikalność komórkową ASO, dwufunkcyjne ASO nie były intensywnie testowane na myszach i nie są obecnie rozwijane klinicznie.62
Po wykazaniu, że ASO ukierunkowane na ISS-N1 są niezwykle skuteczne w promowaniu inkluzji eksonu 7, kolejnym strategicznym pytaniem było określenie, który szkielet ASO byłby najlepiej wykorzystany w potencjalnej terapii SMA. Oligonukleotydy wchodzące w skład ASO są zazwyczaj modyfikowane w celu optymalizacji właściwości farmaceutycznych, takich jak wychwyt komórkowy, toksykologia, farmakokinetyka i wiązanie z celem. Wspólną adaptacją, która powstała w wyniku współpracy pomiędzy firmą Ciba-Geigy Ltd. (obecnie znana jako Novartis), jest ASO. (obecnie znana jako Novartis) i Isis Pharmaceuticals (obecnie znana jako Ionis Pharmaceuticals), jest 2′-O-metoksyetyl (2′-MOE), który zwiększa zarówno odporność ASO na degradację przez nukleazę, jak i powinowactwo do hybrydyzacji.70 Udowodniono, że oligonukleotydy 2′-MOE są bardzo bezpieczne u gryzoni i naczelnych, w tym u ludzi.62 Podawanie 2′-MOE ASO blokującego ISS-N1 skutecznie zwiększyło liczbę eksonów 7 SMN2 w sposób zależny od dawki i czasu u myszy z SMA, poprawiając patologię nerwowo-mięśniową i radykalnie zwiększając przeżywalność.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals, we współpracy z Biogen, opracowuje terapię 2′-MOE ASO o nazwie nusinersen (znaną również jako IONIS-SMNRx, a wcześniej ISIS-SMNRx). Badania przedkliniczne nusinersenu u ssaków naczelnych wykazały, że pojedyncze wstrzyknięcie śródszpikowe może spowodować stężenia w tkankach niezbędne do uzyskania znaczącej poprawy w zakresie inkluzji eksonu 7, a stężenia te utrzymywały się przez kilka miesięcy.62 Długi okres półtrwania leku oznacza, że pacjenci mogą potrzebować wstrzyknięcia dożylnego jedynie co kilka miesięcy.73 W otwartym badaniu fazy 1 u pacjentów z SMA typu II/III w wieku 2-14 lat pojedyncze wstrzyknięcie nusinersenu było dobrze tolerowane i wydaje się, że korelowało ze zwiększoną punktacją w skali HFMSE przy najwyższej dawce.74 W czerwcu 2015 r. firma Ionis opublikowała nowe dane z trwającego otwartego badania fazy 2 nusinersenu u niemowląt z typem I, które wykazało, że niemowlęta żyły dłużej i osiągnęły więcej kamieni milowych w zakresie motoryki niż można by się spodziewać na podstawie naturalnej historii choroby.75 Ponadto mechanizm działania leku został poparty danymi wskazującymi na zwiększenie ilości mRNA SMN2 o pełnej długości oraz białka SMN w tkankach mózgu i rdzenia kręgowego pochodzących z autopsji pacjentów, którzy otrzymali leczenie. Firma Ionis opublikowała również dane z otwartego, rozszerzonego badania fazy 2 u dzieci z SMA typu II/III, w którym u 57% uczestników uzyskano co najmniej trzypunktową poprawę w skali HFMSE oraz średnią poprawę o 55 m w teście 6-minutowego marszu (6MWT).76 Obecnie prowadzone są badania 3. fazy nusinersenu zarówno u niemowląt, jak i u dorosłych z SMA (NCT02193074; NCT02292537); wyniki powinny być dostępne w 2017 r.
Chociaż nie zaobserwowano dotychczas żadnych problemów związanych z bezpieczeństwem stosowania 2′-MOE w terapii SMA, w innych populacjach pacjentów zaobserwowano pewne toksyczności związane z 2′-MOE ASO.77,78 Inną modyfikacją szkieletu badaną pod kątem zastosowania w SMA, która może ominąć te problemy, są oligomery morfolino fosforoamidowe (PMO). Wykazano, że PMOs są bardziej skuteczne niż 2′-MOE w mysich modelach dystrofii mięśniowej Duchenne’a (DMD), innej dziecięcej choroby nerwowo-mięśniowej, i były również dobrze tolerowane u pacjentów z DMD.79 Wstrzyknięcie ICV morfolino ASOs komplementarnych do ISS-N1 znacząco poprawiło przeżywalność myszy z SMA bez oznak toksyczności ze strony ośrodkowego układu nerwowego (CNS).80,81 Morfolina ukierunkowana na ISS-E1, intronowy tłumik splicingu znajdujący się przed eksonem 7, również poprawia fenotyp myszy z SMA.82 To podejście nie zostało jeszcze zastosowane w klinice.
Skład chemiczny szkieletu ASO może wpływać na przydatność do różnych metod podawania, konieczność powtarzania dawek i powodować związane z tym toksyczności – wszystkie te czynniki mają istotny wpływ na jego zastosowanie terapeutyczne. Ponadto, ASO stosowany w leczeniu SMA musi pozostać farmakologicznie aktywny w tkankach OUN, szczególnie w neuronach ruchowych. Niezależnie od szkieletu, każdy ASO przeznaczony do terapii SMA będzie prawdopodobnie musiał być podawany bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez iniekcję domózgową. Chociaż niektóre badania wykorzystujące obwodowe podawanie ASO u noworodków myszy wykazały skuteczność, bariera krew-mózg nie jest w pełni ukształtowana u młodych myszy i obwodowo podawany ASO jest w stanie przeniknąć do OUN w stopniu, który nie jest możliwy u ludzi.71 Zachęcające jest to, że wykazano, iż ASO wstrzykiwane śródszpikowo szeroko rozprowadzają się w ważnych tkankach OUN, takich jak neurony ruchowe, astrocyty i mikroglej.72,83-Chociaż wstrzyknięcie śródszpikowe jest nieco inwazyjne i wymaga sedacji lub znieczulenia, ASO mają kilka istotnych zalet w porównaniu z innymi metodami eksperymentalnymi, w tym wysoką swoistość docelową, niezwykłą skuteczność, niewielką toksyczność w porównaniu z ogólnoustrojowym podawaniem ASO oraz stosunkowo proste procesy produkcyjne w porównaniu z lekami biologicznymi (ale nie małymi cząsteczkami). Więcej informacji można znaleźć w rozdziale 18.
.