Białka fluorescencyjne z A. victoria
Właściwości spektralne GFP lub jego wariantów są związane ze strukturą aminokwasów tworzących chromofor (Rysunek 1). Mogą to być trzy aminokwasy w pozycjach 65-67 lub reszty w pobliżu tej lokalizacji (np. YFP). Poza głównymi mutacjami dotyczącymi chromoforu, prowadzono również badania nad innymi mutagenezami ukierunkowanymi na miejsce, mającymi na celu poprawę innych czynników, takich jak dojrzewanie białka i ekspresja w heterologicznych systemach komórkowych (np. wykorzystanie kodonów, składanie białka w temperaturze fizjologicznej). Należy pamiętać, że A. victoria jest stosunkowo prymitywnym organizmem morskim nie posiadającym systemu cieplnego ciała.
Nawet jeśli GFP jest jednym z najbardziej popularnych FP ze względu na swoją jasność i wysoką fotostabilność, ma dwie główne wady. Są to pewna wrażliwość na pH i niewielka skłonność do dimeryzacji. Dimeryzacja lub oligomeryzacja jest problemem wielu FP. Ich skłonność do aglutynacji ze sobą może powodować artefakty lub błędne interpretacje dotyczące lokalizacji i funkcji fuzyjnego białka. Naukowcy znaleźli jednak kilka odpowiedzi na ten problem. Mutacje w krytycznych pozycjach (F223R, L221K i A206K), gdzie niepolarne aminokwasy są zastępowane przez hydrofilowe, wykazują zmniejszoną dimeryzację. Wszystkie zmiany genetyczne, które prowadzą do poprawy właściwości zarówno spektralnych jak i praktycznych są podsumowywane pod nazwą „ulepszonych” FP.
W przypadku wtGFP, ulepszenia prowadzą do EGFP (enhanced GFP) z pojedynczym pikiem wzbudzenia przy 488 nm zamiast poprzedniego złożonego widma absorpcji przy 395 nm i 475 nm. Pierwsza zmutowana wersja wtGFP (mutant S65T) opracowana przez Rogera Tsien i wsp. była pięciokrotnie jaśniejsza od oryginału i wykazywała krótszy czas dojrzewania. Wraz z lepszą wydajnością dojrzewania w temperaturze 37°C, opartą na innej mutacji (F64L), odgrywa to ważną rolę dla osób przyglądających się żywym komórkom.
Bardzo interesującym wariantem GFP z jednym z największych przesunięć Stokesa jest Sapphire. Mutacja w pozycji blisko chromoforu (T203I) prowadzi do zmiany maksimum wzbudzenia na 399 nm, a maksimum emisji na 511 nm. Jest to przesunięcie Stokesa o 112 nm. Emerald jest kolejną modyfikacją GFP o poprawionej fotostabilności i jasności oraz bardziej wydajnym składaniu w komórkach ssaków.
Podczas gdy wszystkie zielone białka fluorescencyjne mają stosunkowo wysoką jasność, niebieskie białka fluorescencyjne zwykle cierpią z powodu zmniejszonej intensywności emisji w zastosowaniach mikroskopowych. Niemniej jednak, są one wykorzystywane w testach optycznych ze względu na inne właściwości spektralne. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) zostało skonstruowane przez kilka rund mutacji wtGFP. Pierwsza z nich (Y66H) pomijała pik emisyjny z widma zielonego na niebieskie. Kolejne mutacje doprowadziły do powstania białka o maksimum wzbudzenia przy 380 nm i maksimum emisji przy 448 nm. Te właściwości spektralne czynią je partnerem dla EGFP w mikroskopii FRET. Najnowsze niebieskie białka fluorescencyjne o wyższej wydajności kwantowej i lepszej fotostabilności to Azurite, SBFP2 i EBFP2. Obiecującym następcą EBFP jest białko o nazwie Sirius, które stało się popularne ze względu na bardzo wysoką tolerancję na pH (stabilne od pH 3-9) oraz reputację białka fluorescencyjnego o najkrótszej jak dotąd długości fali emisyjnej.
Drugą „niebieską” klasę wariantów GFP tworzą białka fluorescencyjne cyjanowe: CFPs. Zastąpienie tyrozyny tryptofanem (Y66W) i dalsze modyfikacje genetyczne prowadzą do uzyskania fluorochromu o zwiększonej jasności i fotostabilności. Ten ECFP ma bimodalne widmo wzbudzenia i emisji przy 433/445 nm i 475/503 nm. Jasność wynosi tylko około 40 % jasności EGFP. Ważnym wariantem ECFP jest Cerulean, który ma wyższy współczynnik ekstynkcji i wydajność kwantową. Jest on 1,5 raza jaśniejszy od ECFP i jest używany jako partner FRET z YFP.
Mutacja GFP nie zmieniająca bezpośrednio jednego z trzech centralnych aminokwasów w chromoforze spowodowała powstanie żółtych białek fluorescencyjnych. YFP mają wspólną treoninę w pozycji 203, która jest zamieniona na tyrozynę (T203Y). Aminokwas ten jest częścią beleczki β i leży w bliskim sąsiedztwie chromoforu. W porównaniu z GFP, właściwości wzbudzenia i emisji zostały przesunięte na dłuższe fale, z maksimami wzbudzenia i emisji przy 514 nm i 527 nm (EYFP). Jedną z cech EYFP jest jego wrażliwość na pH. Przy pH 6,5 EYFP wykazuje tylko około 50 % swojej fluorescencji, co nie zawsze jest wadą. Jeśli chodzi o pomiar pH (np. pęcherzyków, endosomów itp.), EYFP może być stosowany jako wskaźnik. Co ciekawe, kolejna mutacja (Q69M) spowodowała lepszą stabilność kwasową i radykalnie poprawiła jasność (75% jaśniejsze od EGFP). Białko to, które nadal ma słabą fotostabilność w porównaniu do EGFP, nazwano Citrine. Inny mutant YFP (F46L) wykazał drastycznie szybsze dojrzewanie, a także lepszą odporność na pH. Białko to zostało nazwane Venus i jest częstym akceptorem FRET z Cerulean.
.