Wymagania dotyczące próbek i procedura
Testy ELISA są wykonywane na płytkach polistyrenowych, zwykle na płytkach 96-dołkowych pokrytych powłoką, która bardzo silnie wiąże białko. W zależności od typu testu ELISA, badanie wymaga pierwotnego i/lub wtórnego przeciwciała wykrywającego, analitu/antygenu, przeciwciała/antygenu powlekającego, buforu, płukania i substratu/chromogenu. Pierwotne przeciwciało detekcyjne jest specyficznym przeciwciałem, które wiąże się tylko z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, podczas gdy wtórne przeciwciało detekcyjne jest drugim przeciwciałem sprzężonym z enzymem, które wiąże przeciwciało pierwotne, które nie jest sprzężone z enzymem.
Istnieją cztery główne ogólne etapy wykonywania testu immunologicznego ELISA. Kroki te to:
-
Pokrywanie (antygenem lub przeciwciałem)
-
Blokowanie (zwykle z dodatkiem albuminy surowicy bydlęcej )
-
Detekcja
-
Odczyt końcowy
.
Detekcja jest przeprowadzana przez dodanie substratu, który może generować kolor. Istnieje wiele substratów dostępnych do stosowania w ELISA do wykrywania. Jednakże, najczęściej używane są peroksydaza chrzanowa (HRP) i fosfataza alkaliczna (ALP). Substratem dla HRP jest nadtlenek wodoru i powoduje on niebieską zmianę koloru. ALP mierzy żółty kolor nitrofenolu po 15-30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej i zwykle używa P-nitrofenylo-fosforanu (pNPP) jako substratu.
Pomiędzy każdym z powyższych czterech etapów następuje „płukanie” płytki przy użyciu buforu, takiego jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) i niejonowy detergent, w celu usunięcia niezwiązanego materiału. Studzienki są przemywane dwa lub więcej razy podczas każdego etapu przemywania, w zależności od konkretnego protokołu, który jest przestrzegany.
W protokole ELISA, zazwyczaj, seryjne rozcieńczenie stężeń jest umieszczane w studzienkach płytki. Po zmierzeniu wyników wykreślana jest krzywa standardowa z danych seryjnych rozcieńczeń, ze stężeniem na osi x przy użyciu skali logarytmicznej i absorbancji na osi y przy użyciu skali liniowej.
Istnieją cztery główne typy testu ELISA:
-
Direct ELISA (płytka pokryta antygenem; przeciwciało przesiewowe)
-
Indirect ELISA (płytka pokryta antygenem; antygen/przeciwciało przesiewowe)
-
Sandwich ELISA (płytka pokryta przeciwciałem; przesiewowy antygen)
-
Kompetycyjny ELISA (przesiewowy antygen/przeciwciało)
Bezpośredni ELISA
Bezpośredni i bezpośredni ELISA rozpoczynają się od pokrycia antygenem płytek ELISA. Pierwszy etap wiązania obejmuje dodanie antygenu do płytek, które są inkubowane przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni C lub mogą być inkubowane w temperaturze 4 stopni C przez całą noc. Po zakończeniu etapu inkubacji, następnym krokiem jest wypłukanie płytek z wszelkich potencjalnych niezwiązanych przeciwciał i zablokowanie wszelkich niezwiązanych miejsc na płytce ELISA za pomocą środków takich jak BSA, owalbumina, aprotynina lub inne białka zwierzęce. Ten drugi krok jest ważny, ponieważ zapobiega wiązaniu się jakichkolwiek niespecyficznych przeciwciał z płytką i minimalizuje wyniki fałszywie dodatnie. Po dodaniu buforu, płytka jest ponownie płukana i dodawane jest wybrane, sprzężone z enzymem, pierwotne przeciwciało detekcyjne. Płytka jest dalej inkubowana przez jedną godzinę.
W bezpośredniej metodzie ELISA, pierwotne przeciwciało detekcyjne wiąże się bezpośrednio z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie, płytka jest ponownie płukana w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał, po czym następuje dodanie substratu/chromoforu, takiego jak fosfataza alkaliczna (AP) lub peroksydaza chrzanowa (HRP) do płytki, co powoduje zmianę koloru. Zmiana koloru próbki następuje w wyniku hydrolizy grup fosforanowych z substratu przez AP lub utleniania substratów przez HRP. Zalety stosowania bezpośredniego testu ELISA obejmują wyeliminowanie reaktywności krzyżowej przeciwciał drugorzędowych, a ze względu na mniejszą liczbę etapów jest on szybki w porównaniu z pośrednim testem ELISA. Jej wady obejmują niską czułość w porównaniu z innymi typami testu ELISA i wysoki koszt reakcji.
Pośredni test ELISA
Kroki pośredniego testu ELISA są identyczne z bezpośrednim testem ELISA, z wyjątkiem dodatkowego etapu płukania i typów przeciwciał dodawanych po usunięciu buforu. Pośredni test ELISA wymaga dwóch przeciwciał, pierwotnego przeciwciała wykrywającego, które przywiera do białka będącego przedmiotem zainteresowania i wtórnego przeciwciała związanego enzymatycznie, komplementarnego do przeciwciała pierwotnego. Przeciwciało pierwotne jest dodawane jako pierwsze, po czym następuje etap płukania, a następnie dodawane jest przeciwciało wtórne sprzężone z enzymem i inkubowane. Po tym, kroki są takie same jak w przypadku bezpośredniego testu ELISA, który obejmuje etap płukania, dodanie substratu i wykrywanie zmiany koloru.
Pośredni test ELISA ma wyższą czułość w porównaniu z bezpośrednim testem ELISA. Jest również mniej kosztowna i bardziej elastyczna ze względu na wiele możliwych przeciwciał pierwotnych, które mogą być użyte. Jedyną poważną wadą tego typu testu ELISA jest ryzyko reaktywności krzyżowej między drugorzędowymi przeciwciałami detekcyjnymi.
Sandwich ELISA
W przeciwieństwie do bezpośredniego i pośredniego testu ELISA, test sandwich ELISA rozpoczyna się od przeciwciała wychwytującego pokrytego na studzienkach płytki. Jest ona określana jako „sandwich”, ponieważ antygeny są umieszczone pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał (przeciwciała wychwytujące i wykrywające). Po dodaniu przeciwciała wychwytującego do płytek, płytki są następnie przykrywane i inkubowane przez noc w temperaturze 4°C. Po zakończeniu etapu powlekania, płytki są przemywane PBS, a następnie buforowane/blokowane BSA. Przemywanie buforem przeprowadza się przez co najmniej 1-2 godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec, przed dodaniem antygenu, płytka jest jeszcze raz przemywana PBS.
Zainteresowany antygen jest następnie dodawany do płytek, aby związać się z przeciwciałem wychwytującym i inkubowany przez 90 minut w temperaturze 37 stopni C. Płytka jest ponownie przemywana, a pierwotne przeciwciało wykrywające jest następnie dodawane do płytki i inkubowane przez kolejną 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie przemywane buforem. Następnie dodawane jest drugorzędowe przeciwciało sprzężone z enzymem i inkubowane przez kolejną 1 do 2 godzin. Płytka jest ponownie płukana, a następnie dodawany jest substrat w celu uzyskania zmiany koloru. Metoda kanapkowa ELISA ma najwyższą czułość spośród wszystkich typów ELISA. Głównymi wadami tego typu testu ELISA są czas i koszty oraz konieczne użycie „dopasowanej pary” (antygen dwu-/wielowartościowy) i przeciwciał drugorzędowych.
Kompetycyjny test ELISA
Kompetycyjny test ELISA sprawdza obecność przeciwciała specyficznego dla antygenów w testowanej surowicy. Ten typ testu ELISA wykorzystuje dwa specyficzne przeciwciała, przeciwciało sprzężone z enzymem i inne przeciwciało obecne w testowanej surowicy (jeżeli surowica jest pozytywna). Połączenie tych dwóch przeciwciał w studzienkach umożliwi konkurencję o wiązanie z antygenem. Obecność zmiany koloru oznacza, że test jest negatywny, ponieważ przeciwciało sprzężone z enzymem związało antygeny (a nie przeciwciała surowicy testowej). Brak koloru wskazuje na pozytywny wynik testu i obecność przeciwciał w surowicy testowej. Kompetycyjna metoda ELISA ma niską swoistość i nie może być stosowana w rozcieńczonych próbkach. Jednakże, zaletą tego testu jest mniejsza potrzeba oczyszczania próbki, możliwość pomiaru szerokiego zakresu antygenów w danej próbce, możliwość stosowania do małych antygenów i niska zmienność.
.