Enzymatyczna konwersja mRNA w dwuniciowy insertowy DNA może być osiągnięta przez szereg różnych procedur. Wszystkie z nich obejmują działanie odwrotnej transkryptazy i syntezę cDNA wspomaganą oligonukleotydami. Następnie, procedury będące w powszechnym użyciu znacznie się różnią. Istnieje szereg metod syntezy drugiej nici oraz kilka procedur wytwarzania odpowiednich końców do klonowalnego DNA. Głównym celem tych procedur jest skonstruowanie insertu DNA, który jest tak długi, jak to tylko możliwe, z wysoką wydajnością przekształcania mRNA w DNA, który może ligować do wektorowego DNA. Poniższe protokoły wymagają jedynie komercyjnie dostępnych odczynników i są zazwyczaj skuteczne w produkcji dobrych bibliotek cDNA. Protokół podstawowy opisuje metodę tworzenia cDNA o tępych końcach, które mogą być następnie ligowane z linkerami w celu późniejszego klonowania do unikalnego miejsca restrykcyjnego, takiego jak EcoRI. Alternatywny protokół jest odmianą, która wymaga mniejszej ilości manipulacji enzymatycznych i pozwala na konstruowanie kierunkowych bibliotek cDNA, które są szczególnie pożądane, gdy celem jest generowanie ekspresyjnych bibliotek cDNA. Alternatywny protokół wykorzystuje linker-primer składający się (w kolejności od 3′ do 5′) ze startera oligo(dT), miejsca restrykcyjnego dla endonukleazy XhoI oraz powtórzenia (GA)20 w celu ochrony miejsca restrykcyjnego podczas generowania tępo zakończonego cDNA. Wewnętrzne miejsca XhoI na poszczególnych cząsteczkach cDNA są chronione przez włączenie 5-metylo-dCTP do mieszanki nukleotydów pierwszej nici. Powstałe w ten sposób cDNA o unikalnych końcach mogą być klonowane do wektorów trawionych EcoRI /XhoI po ligacji adaptorów EcoRI do 5′ końca i trawieniu przez XhoI w celu uwolnienia 3′ miejsc XhoI, które zostały włączone do cDNA przez linker-primer. Zmiany te skutkują znacznie usprawnioną procedurą, która jest znacznie szybsza i łatwiejsza niż protokół podstawowy.
Localizador
Blog Network
