Localizador
Blog Network
Localizador

Cytotoxicity study of polyethylene glycol derivatives

Open Access Article
This Open Access Article is licensed under a
Creative Commons Attribution 3.0 Unported Licence

DOI: 10.1039/C7RA00861A(Paper)RSC Adv., 2017, 7, 18252-18259

Guoqiang Liua, Yongsan Liab, Lei Yangd, Yen Weia, Xing Wangb, Zhiming Wangc and Lei TaoORCID logo*a
aKey Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, P. R. China. E-mail: [email protected]
bThe State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, P. R. China
cCollege of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, Zhejiang 311400, P. R. China
dCancer Institute & Hospital, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100021, P. R. China

Otrzymano 20 stycznia 2017, Zaakceptowano 18 marca 2017

Pierwsza publikacja 27 marca 2017

Pochodne glikolu polietylenowego (PEG) były szeroko stosowane w badaniach związanych z biologią. Jednak oligomery PEG (o różnych masach cząsteczkowych) lub monomery na bazie PEG (z różnymi grupami końcowymi łańcucha) w rzeczywistości mają różne właściwości chemiczne i fizyczne, co może prowadzić do potencjalnej toksyczności. W niniejszej pracy dokonano pomiarów cytotoksyczności serii pochodnych PEG (oligomerów i monomerów) z wykorzystaniem ludzkich komórek raka szyjki macicy (HeLa) oraz linii komórkowej fibroblastów pochodzących od myszy (L929) jako komórek modelowych. Większość oligomerów PEG jest bezpieczna dla obu typów komórek, z wyjątkiem glikolu trietylenowego (TEG), który w wysokich stężeniach jest toksyczny dla komórek L929. Z drugiej strony, monomery na bazie PEG, w tym akrylan eteru metylowego glikolu poli(etylenowego) (mPEGA) i metakrylan eteru metylowego glikolu poli(etylenowego) (mPEGMA) wykazują oczywistą cytotoksyczność. Następnie, te toksyczne pochodne PEG były badane w celu ujawnienia różnych mechanizmów ich toksyczności. Obecne badania oceniały cytotoksyczność pochodnych PEG i wskazywały na potencjalne zagrożenie „bezpiecznych” biomateriałów, które mogą stanowić użyteczne odniesienie dla osób wykorzystujących pochodne PEG w przyszłych badaniach biomedycznych.

Wprowadzenie

Glikol polietylenowy (PEG) był szeroko stosowany w różnych dziedzinach medycyny ze względu na jego wyjątkowe właściwości, takie jak zadowalające bezpieczeństwo, biokompatybilność, hydrofilowość itp. Na przykład, PEG został wykorzystany w niektórych środkach przeczyszczających zatwierdzonych przez Food and Drug Administration z powodu jego doskonałej zdolności do zatrzymywania wilgoci i smarowania.1-3 W innym przykładzie, modyfikowanie leków/białek za pomocą PEG (PEGylacja) może skutecznie poprawić ich rozpuszczalność w wodzie i okres półtrwania w obiegu leków,4,5 co skutkuje zwiększonym bezpieczeństwem i efektami terapii. PEGylacja staje się jedną z najbardziej atrakcyjnych biotechnologii i osiąga ogromne sukcesy w badaniach podstawowych i na rynku.6-11 Do tej pory wiele pochodnych PEG zostało wykorzystanych jako doskonałe materiały wyjściowe do syntezy szeregu nowych materiałów polimerowych do bioaplikacji.12 Na przykład liniowy PEG został zmodyfikowany jako difunkcjonalizowany PEG (DF-PEG), który może być użyty do szybkiego wygenerowania interesującego samoregenerującego się hydrożelu.13,14 Niektóre oligomery PEG zostały wykorzystane do modyfikacji powierzchni nanocząstek nieorganicznych w celu poprawy rozpuszczalności w wodzie i zmniejszenia toksyczności tych materiałów nieorganicznych.15-Niektóre komercyjne monomery na bazie PEG, takie jak akrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) (mPEGA) i metakrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) (mPEGMA) zostały wykorzystane do przygotowania rozgałęzionych polimerów do późniejszego sprzęgania z białkami, samoorganizacji, dostarczania leków itp.18-27

Chociaż PEG jest zwykle uważany za prawie nietoksyczny, niektóre niebezpieczne problemy związane z PEG o niskiej masie cząsteczkowej zostały zauważone przez badaczy. Smyth i wsp. wykazali przewlekłą toksyczność doustną oligomeru PEG (Mn ∼ 200) u szczurów,28,29 niekorzystne wyniki zaobserwowano również u małp,30 sugerując potencjalne problemy bezpieczeństwa tych „bezpiecznych” materiałów. Dlatego, biorąc pod uwagę szerokie zastosowanie pochodnych PEG w obszarach badawczych, systematyczne badanie cytotoksyczności tych oligomerów PEG i monomerów na bazie PEG jest konieczne i ważne dla ich dalszego zastosowania w dziedzinach biologicznie związanych (Schemat 1).

image file: c7ra00861a-s1.tif

Schemat 1 Możliwa cytotoksyczność pochodnych PEG o różnych ciężarach cząsteczkowych i grupach końcowych.

W obecnej pracy oceniano cytotoksyczność niektórych oligomerów PEG (o różnych ciężarach cząsteczkowych) oraz komercyjnych monomerów na bazie PEG (o różnych grupach końcowych łańcucha) w stosunku do ludzkich komórek raka szyjki macicy (HeLa) oraz linii komórkowej fibroblastów pochodzących od myszy (L929). Zaobserwowano zależną od ciężaru cząsteczkowego cytotoksyczność oligomerów PEG, a także po raz pierwszy ujawniono różne mechanizmy cytotoksyczności oligomerów PEG i monomerów na bazie PEG. Te informacje o cytotoksyczności pochodnych PEG mogą stanowić cenne referencje dla osób wybierających PEG jako materiały wyjściowe i projektujących drogi oczyszczania w celu przygotowania biokompatybilnych materiałów na bazie PEG do dalszych zastosowań biomedycznych.

Materiały i metody

2.1 Substancje chemiczne

Glikol trietylenowy (TEG, 97%, HEOWNS), PEG-400 (Mn ∼ 400, TCI), PEG-1000 (Mn ∼ 1000, Jiangsu Haitian Petrochemical Works), PEG-2000 (Mn ∼ 2000, SCRC), PEG-4000 (Mn ∼ 4000, SCRC), akrylan eteru metylowego poli(glikolu etylenowego) 480 (mPEGA-480, Mn ∼ 480, Sigma-Aldrich), metakrylan eteru metylowego glikolu poli(etylenowego) 500 (mPEGMA-500, Mn ∼ 500, Sigma-Aldrich) i metakrylan eteru metylowego glikolu poli(etylenowego) 950 (mPEGMA-950, Mn ∼ 950, Sigma-Aldrich) stosowano bezpośrednio bez dalszego oczyszczania.

Ludzkie komórki raka szyjki macicy (HeLa) i linię komórkową fibroblastów pochodzących od myszy (L929) pozyskano z American type culture collection (ATCC). Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM, Corning-Cellgro), Phosphate Buffered Saline (PBS, pH ∼ 7,2-7,4, 0,01 M, Solarbio), fetal bovine serum (FBS, Gibco), Roswell Park Memorial Institute 1640 culture medium (RPMI 1640 culture medium, Gibco), penicillin-streptomycin solution (Gibco), trypsin-EDTA (Gibco, 0.25%), 4-(3-(2-metoksy-4-nitrofenylo)-2-(4-nitrofenylo)-2H-tetrazol-3-ium-5-ylo)benzeno-1,3-disulfonian (CCK-8, Beyotime), dioctan 2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA, Beyotime), utleniony glutation (GSSG, Beyotime), fosforan dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADPH, Beyotime), 5,5′-ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB, Beyotime), dioctan fluoresceiny (FDA, Sigma) i jodek propidium (PI, 94%, Sigma) zostały użyte tak jak je zakupiono.

2.2 Hodowla komórek

Hodowla komórek była utrzymywana w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2, pożywka hodowlana była zmieniana co jeden lub dwa dni w celu utrzymania wykładniczego wzrostu komórek. Komórki HeLa pochodziły z komórek raka szyjki macicy i były hodowane w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) oraz 1% penicyliną i streptomycyną. Komórki L929 pochodziły od myszy i były hodowane w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną i streptomycyną.

2.3 Analiza cytotoksyczności

2.3.1 Badanie żywotności komórek. Ocenę żywotności komórek oligomerów PEG i trzech monomerów na bazie PEG w stosunku do komórek HeLa i L929 przeprowadzono przy użyciu zestawu do zliczania komórek-8 (CCK-8),31 ulepszonej wersji testu MTT (pomiar rozszczepienia pierścienia tetrazolowego i tworzenia formazanu w żywych komórkach). Zazwyczaj komórki wysiewano na płytce 96-dołkowej w gęstości ∼5 × 104 komórek na mL w 100 μL odpowiedniego podłoża zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny i streptomycyny. Po przyłączeniu, komórki przemywano PBS i hodowano z różnymi stężeniami pochodnych PEG w podłożu hodowlanym przez 24 h, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Traktowane komórki hodowano w 100 μL pożywki z 10% roztworem CCK-8 w temperaturze 37 °C przez 2 h, a następnie analizowano przy użyciu czytnika mikropłytek (VICTOR™ X3 PerkinElmer 2030 Multilabel Plate Reader). Absorbancja barwnika była mierzona pod 450 nm, a redukcja barwnika CCK-8 była porównywana z kontrolą pozytywną (komórki w czystym medium hodowlanym, 100% redukcji barwnika CCK-8) i kontrolą negatywną (brak komórek w płytce, 0% redukcji barwnika CCK-8), stosunek absorbancji do kontroli pozytywnej i kontroli negatywnej odzwierciedla żywotność komórek.

Wyniki zostały przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD), a wartości pół maksymalnego stężenia hamującego 50% (IC50) pochodnych PEG zostały obliczone przez SPSS 15.0.

2.3.2 Obserwacja morfologii komórek. Komórki L929 wysiewano na płytce 24-dołkowej w gęstości ∼5 × 104 komórek na mL. Po przyłączeniu, komórki przemywano PBS i hodowano w pożywce zawierającej różne stężenia pochodnych PEG przez 24 h. Następnie obserwowano zmiany morfologii komórek L929 eksponowanych na pochodne PEG za pomocą mikroskopu optycznego (Leica Germany).

Zgodnie z naszą wcześniejszą pracą,32,33 diacetat fluoresceiny (FDA) i jodek propidium (PI) mogą być stosowane jako szybka i wygodna metoda podwójnego barwienia do obserwacji żywotności komórek. Komórki L929 posiano na płytce 24-dołkowej w gęstości ∼5 × 104 komórek na mL. Po przyłączeniu, komórki przemywano PBS i hodowano z różnymi stężeniami pochodnych PEG w podłożu hodowlanym przez 24 h. Następnie usuwano podłoże, a komórki przemywano PBS. Następnie dodawano roztwór mieszany PBS-FDA-PI (FDA: 3 μg mL-1; PI: 3 μg mL-1) i inkubowano płytkę 24-dołkową w temp. 37 °C przez 15 min. Do obserwacji żywych i martwych komórek użyto mikroskopu fluorescencyjnego (Leica Germany) pod 450-490 nm i 515-560 nm pasmowo-przepustowymi filtrami wzbudzającymi (I3 i N2.1), odpowiednio (lampa rtęciowa 100 W).

2.3.3 Generowanie tlenu rodnikowego (ROS). Wewnątrzkomórkowy stres oksydacyjny z oligomerów i monomerów PEG jest wyświetlany jako poziom ROS. Dioctan 2,7-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA) został użyty do pomiaru generowania ROS.34 Zazwyczaj komórki L929 posiewano na płytkę 96-dołkową, po usunięciu podłoża hodowlanego, komórki przemywano PBS i hodowano w 100 μL roztworu roboczego zawierającego DCFH-DA (10 μmol L-1) w temperaturze 37 °C przez 1 h. Następnie komórki przemywano PBS trzykrotnie i inkubowano w podłożu hodowlanym zawierającym różne stężenia TEG lub mPEGA-480 odpowiednio przez 0,5, 1, 1,5 i 2,0 h. Zmiany fluoresceiny w komórkach (485 nm/535 nm) były rejestrowane przez czytnik mikropłytek (VICTOR™ X3 PerkinElmer 2030 Multilabel Plate Reader). Intensywność fluorescencji komórek w czystym medium hodowlanym została użyta jako kontrola, wartości generacji ROS zostały pokazane jako względna intensywność fluorescencji w porównaniu z kontrolą i przedstawione jako średnia ± SD.
2.3.4 Obniżenie poziomu zredukowanego glutationu (GSH). 5,5′-Ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB) został użyty do pomiaru poziomu zredukowanego glutationu. Wszystkie kroki były zgodne z instrukcją producenta.

Skrótowo, komórki L929 zostały posiane na płytce 24-dołkowej i inkubowane w 0,5 mL podłoża hodowlanego z różnymi stężeniami TEG (A, A′) przez 1 h (Fig. 1), studzienki A1-A6 były używane do pomiaru całkowitej ilości glutationu (GSH + GSSG), podczas gdy studzienki A′1-A′6 były używane do pomiaru ilości utlenionego glutationu (GSSG) w obecności TEG. Po 1 h, komórki zbierano przez trawienie trypsyną i wirowanie (1000 rpm, 5 min). Następnie dodawano potrójną objętość roztworu usuwającego białka (50 mg mL-1) w celu usunięcia szumiących białek. Po trzykrotnym szybkim zamrożeniu i rozmrożeniu w ciekłym azocie i w łaźni wodnej w temp. 37°C zawiesinę umieszczano w lodówce (4°C) na 5 min, a próbki supernatantu komórkowego uzyskiwano po odwirowaniu (10000 rpm, 10 min). Próbki z dołków A1-A6 zostały użyte do pomiaru całkowitego poziomu glutationu (GSH + GSSG). Dodawano roztwór NADPH (0,5 mg mL-1) w celu zredukowania całego glutationu do GSH, następnie stosowano 5,5′-ditiobis-(kwas 2-nitrobenzoesowy) (DTNB) w celu utlenienia GSH, a zmienioną absorbancję przy 405 nm rejestrowano za pomocą czytnika mikropłytek (VICTOR™ X3 PerkinElmer 2030 Multilabel Plate Reader).35,36 Próbki z dołków A′1-A′6 wykorzystano do pomiaru poziomu utlenionego glutationu (GSSG). Dzięki zastosowaniu roztworu usuwającego GSH, w roztworze próbki pozostawiono tylko GSSG. Próbki były analizowane tą samą metodą co powyżej w celu zmierzenia poziomu GSSG. Całkowita ilość glutationu i ilość utlenionego glutationu zostały zebrane w celu obliczenia poziomu zredukowanego glutationu, podczas gdy poziom GSH komórek w czystej pożywce został użyty jako kontrola. Wyniki przedstawiono jako średnie ± SD.

image file: c7ra00861a-f1.tif

Rys. 1 Konfiguracja płytki 24-dołkowej do analizy GSH. Komórki w linii 1 hodowano w czystym podłożu hodowlanym i stosowano jako kontrolę; komórki w studzienkach A2-A6 i A′2-A′6 hodowano z 1, 2, 5, 10 i 20 mg mL-1 TEG, odpowiednio; komórki w studzienkach B2-B6 i B′2-B′6 hodowano z 1, 2, 5, 10 i 20 mg mL-1 mPEGA-480, odpowiednio.

Komórki w linii B i B′ były używane do badania całkowitej ilości GSH i GSSG w obecności mPEGA-480, odpowiednio, poprzez tę samą procedurę.

Wyniki i dyskusja

3.1 Badanie żywotności komórek

3.1.1 Żywotność komórek w obecności oligomerów PEG. Wpływ oligomerów PEG (o różnych ciężarach cząsteczkowych) na wzrost i żywotność komórek badano poprzez 24-godzinną inkubację komórek HeLa lub L929 w roztworach PEG o różnym stężeniu.

Gdy użyto komórki HeLa (model komórek nowotworowych) (Rys. 2A), cytotoksyczność wszystkich oligomerów PEG w niskich stężeniach (≤5 mg mL-1) można było pominąć. Wraz ze wzrostem stężenia (≥10 mg mL-1) obserwowano zależną od masy cząsteczkowej cytotoksyczność próbek PEG. Glikol trietylenowy (TEG) wykazywał oczywistą cytotoksyczność powyżej 10 mg mL-1 (p < 0,05; kontrast z każdym innym oligomerem, gdy stężenie wynosi ponad 5 mg mL-1), a wartość IC50 TEG dla komórek HeLa obliczono na 19,8 mg mL-1. Tymczasem inne oligomery PEG (Mn ∼ 400-4000) również wykazywały niewielką cytotoksyczność.

image file: c7ra00861a-f2.tif

Rys. 2 Zależna od stężenia cytotoksyczność oligomerów PEG w stosunku do komórek HeLa (A) i L929 (B), stężenia PEG wahają się od 1 do 20 mg mL-1. Komórki w czystym podłożu hodowlanym służyły jako kontrola pozytywna, a brak komórek jako kontrola negatywna.

Oceniono również cytotoksyczność oligomerów PEG w stosunku do komórek L929 (model komórek prawidłowych) (ryc. 2B). Zgodnie z oczekiwaniami, żywotność komórek malała wraz ze wzrostem stężenia PEG. Oprócz TEG, niektóre oligomery PEG (PEG-1000, PEG-4000), które są bezpieczne dla komórek HeLa również wykazały wykrywalną cytotoksyczność, wartości IC50 TEG, PEG-1000 i PEG-4000 zostały obliczone jako 12,4, 22,5 i 20,0 mg mL-1 do komórek L929, odpowiednio, również wskazując na zależną od masy cząsteczkowej cytotoksyczność oligomerów PEG.

Powyższe wyniki sugerowały, że komórki HeLa mają lepszą tolerancję na oligomery PEG niż komórki L929 z powodu nieustępliwej żywotności komórek nowotworowych, a TEG ma znacznie wyższą cytotoksyczność niż inne oligomery PEG o wyższych masach cząsteczkowych (p < 0,05; kontrast z każdym innym oligomerem, gdy stężenie jest ponad 5 mg mL-1). Zauważono, że obecne badania wykazały umiarkowaną cytotoksyczność PEG-1000 i PEG-4000 dla komórek L929 oraz prawie niecytotoksyczność PEG-400 i PEG-2000, co różni się od powszechnego wrażenia, że PEG o dużej masie cząsteczkowej powinny być bardziej biokompatybilne niż ich odpowiedniki o małej masie cząsteczkowej. Chociaż powód cytotoksyczności PEG nadal nie jest jasny, PEG-400 i PEG-2000 wydają się być lepszym wyborem dla ludzi do syntezy materiałów biokompatybilnych.

3.1.2 Żywotność komórek w obecności monomerów na bazie PEG. Monomery na bazie PEG, takie jak mPEGA-480, mPEGMA-500 i mPEGMA-950 były często stosowane w chemii polimerów do syntezy polipropylenów do zastosowań biomedycznych. Cytotoksyczność niektórych polipropylenów została szczegółowo zbadana w celu znalezienia bezpiecznej drogi polimeryzacji.37-42 Jednak bardzo ważne informacje dotyczące cytotoksyczności monomerów na bazie PEG nie zostały w pełni zbadane. Tak więc, mieliśmy nadzieję systematycznie badać cytotoksyczność monomerów na bazie PEG. Ta sama procedura (test CCK-8) została zastosowana do porównania procentowej redukcji barwnika CCK-8 z kontrolą pozytywną (komórki w czystym medium hodowlanym) i kontrolą negatywną (brak komórek w płytce), wpływ trzech monomerów na bazie PEG na wzrost i żywotność komórek HeLa i L929 został zbadany po 24 h inkubacji.

Gdy badano mPEGMA-500, żywotność komórek zarówno HeLa jak i L929 malała wraz ze wzrostem stężenia mPEGMA-500 (Rys. 3A), przy czym nie zaobserwowano wyraźnej różnicy pomiędzy dwoma typami komórek. Wartości IC50 mPEGMA-500 wynoszą 4,7 mg mL-1 dla komórek HeLa i 5,3 mg mL-1 dla komórek L929 po 24 h hodowli, co wskazuje na większą cytotoksyczność mPEGMA-500 niż wyżej wymienionych oligomerów PEG i sugeruje, że grupy końcowe łańcucha pochodnych PEG są kluczowe dla ich toksyczności. Gdy mPEGMA-950, inny metakrylan na bazie PEG z tą samą grupą końcową łańcucha, ale o większej masie cząsteczkowej, badano za pomocą tej samej procedury (rys. 3B), zaobserwowano znacznie niższą cytotoksyczność mPEGMA-950 w stosunku do komórek HeLa lub L929 (p < 0,05; gdy stężenie wynosi ponad 2 mg mL-1), wartości IC50 mPEGMA-950 wynoszą 20,8 mg mL-1 do komórek HeLa i 21.7 mg mL-1 do komórek L929 po 24 h hodowli, również wykazując zależną od masy cząsteczkowej cytotoksyczność metakrylanu na bazie PEG.

image file: c7ra00861a-f3.tif

Rys. 3 Zależna od stężenia cytotoksyczność mPEGMA-500 (A), mPEGMA-950 (B) i mPEGA-480 (C i D) w stosunku do komórek HeLa i L929, stężenia mPEGMA od 1 do 20 mg mL-1, stężenia mPEGA od 0,1 do 20 mg mL-1. Komórki bez monomerów na bazie PEG służyły jako kontrola pozytywna, a brak komórek jako kontrola negatywna.

Ponadto badano również akrylan mPEGA-480 na bazie PEG. Chociaż różnica między mPEGA-480 a mPEGMA-500 polega jedynie na obecności grupy metylowej na końcu łańcucha, mPEGA-480 wykazywał ostrą cytotoksyczność (Rys. 3C). Ponad 95% komórek traciło żywotność nawet przy zawartości 1 mg mL-1 mPEGA-480 w medium hodowlanym. W związku z tym, aby określić jego cytotoksyczność, należy przeprowadzić dodatkowe doświadczenia z niższymi stężeniami (ryc. 3D), a wartości IC50 mPEGA-480 zostały obliczone jako 0,2 mg mL-1 do komórek HeLa i 0,1 mg mL-1 do komórek L929 po 24-godzinnej hodowli.

Doświadczenia dotyczące żywotności komórek potwierdziły, że zarówno grupy końcowe łańcucha, jak i masa cząsteczkowa są ważnymi elementami wpływającymi na cytotoksyczność pochodnych PEG, a monomery oparte na PEG wykazywały znacznie bardziej zauważalną cytotoksyczność w porównaniu z oligomerami PEG.

W międzyczasie oceniono również cytotoksyczność inhibitorów w monomerach na bazie PEG, eteru metylowego hydrochinonu (MEHQ, 100 ppm w mPEGA) i butylowanego hydroksytoluenu (BHT, 300 ppm w mPEGMA) (Rys. 4), a komórki L929 zachowały wysoką żywotność (≥90%) przy niskich stężeniach inhibitorów (≤1 μg mL-1). W 1 mg mL-1 mPEGA-480 znajduje się 0,1 μg mL-1 MEHQ, a w 10 mg mL-1 mPEGA-500 – 3 μg mL-1 BHT, przy czym mPEG-480 i mPEGMA-500 wykazują oczywistą cytotoksyczność w tych stężeniach. Tak więc, śladowe ilości inhibitorów w monomerach na bazie PEG wydają się mieć pomijalny wpływ na cytotoksyczność monomerów.

image file: c7ra00861a-f4.tif

Rys. 4 Zależna od stężenia cytotoksyczność dwóch inhibitorów MEHQ i BHT wobec komórek L929, stężenia inhibitorów wahają się od 0,1 do 10 μg mL-1. Komórki bez inhibitora służyły jako kontrola pozytywna, a brak komórek jako kontrola negatywna.

3.2 Obserwacja morfologii komórek

Do bezpośredniej oceny cytotoksyczności pochodnych PEG w stosunku do komórek L929 zastosowano obserwację za pomocą mikroskopu optycznego. Obrazy optyczne komórek L929 eksponowanych na 20 mg mL-1 TEG i 0,1 mg mL-1 mPEGA przez 24 h przedstawiono odpowiednio na Rys. 5A i B.

image file: c7ra00861a-f5.tif

Rys. 5 Obrazy mikroskopu optycznego komórek L929 inkubowanych z 20 mg mL-1 TEG (A) i 0,1 mg mL-1 mPEGA-480 (B) przez 24 h oraz komórek w czystym medium hodowlanym (C, grupa kontrolna). Pasek skali = 200 μm.

Po inkubacji z 20 mg mL-1 TEG przez 24 h, komórki zachowywały podobną morfologię (Rys. 5A) z grupą kontrolną (Rys. 5C, komórki w czystym medium hodowlanym), ale liczba komórek dramatycznie spadła, wskazując na cytotoksyczność TEG w wysokim stężeniu, co prowadziło do śmierci i następowało oderwanie komórek od dna mikropłytki. Rys. 5B pokazał morfologię komórek L929 po inkubacji z 0,1 mg mL-1 mPEGA-480. Prawie wszystkie komórki straciły normalną morfologię, co sugeruje ostrą cytotoksyczność mPEGA-480 nawet w tak niskim stężeniu.

Dodatkowo komórki były również barwione przy użyciu fluoresceiny. Podwójne barwienie FDA/PI jest szybką, prostą i jednoczesną procedurą umożliwiającą obserwację żywych i martwych komórek.43 FDA może wnikać do wnętrza całych komórek i gromadzić się w nich, dlatego konieczna jest pełna błona komórkowa, aby zapobiec wyciekowi fluoresceiny z komórki. Z kolei PI nie może przejść przez nienaruszoną błonę komórkową, ale może wybarwić jądro martwych komórek, przechodząc przez uszkodzoną błonę komórkową. Jak pokazano na Rys. 6, komórki L929 inkubowane z 20 mg mL-1 TEG mają mniej żywotnych komórek po barwieniu FDA (Rys. 6b) w porównaniu z kontrolą (Rys. 6a), a więcej martwych komórek można zaobserwować po barwieniu PI (Rys. Ostra cytotoksyczność mPEGA-480 była również obserwowana po procedurze podwójnego barwienia FDA/PI, nie można było zidentyfikować zielonego sygnału po inkubacji komórek z 0,1 mgL-1 mPEG-480 przez 24 h (Rys. 6c i c′′).

plik obrazu: c7ra00861a-f6.tif

Rys. 6 Obrazy fluorescencyjne komórek L929 inkubowanych z pełnym podłożem hodowlanym jako grupą kontrolną (a, a′ i a′′), 20 mg mL-1 TEG (b, b′ i b′′) i 0.1 mg mL-1 mPEGA-480 (c, c′ i c′′) przez 24 h. Żywe komórki wykazały kolor zielony przy użyciu FDA (wzbudzone światłem niebieskim (a, b i c)), martwe komórki wykazały kolor czerwony przy użyciu PI (wzbudzone światłem zielonym (a′, b′ i c′)), obrazy mieszane zostały wzbudzone światłem niebieskim i zielonym (a′′, b′′ i c′′). Pasek skali = 200 μm.

Zarówno obrazy optyczne, jak i fluorescencyjne intuicyjnie wykazały cytotoksyczność tych pochodnych PEG, dodatkowo wspierając wnioski uzyskane poprzez badania CCK-8. Zauważono, że mPEGA-480 wydawał się bardziej toksyczny w teście podwójnego barwienia FDA/PI, co przypisuje się podwójnemu barwieniu FDA/PI, które rozróżnia kompletność żywej/umarłej błony komórkowej, podczas gdy test CCK-8 wykrywa aktywność dehydrogenazy w mitochondriach, sugerując barwienie FDA/PI jako doskonałe uzupełnienie testu CCK-8, aby zaoferować więcej szczegółów statusu komórki.

3.3 Badanie mechanizmu

Zgodnie z eksperymentami żywotności komórek, wartości IC50 oligomerów PEG i monomerów na bazie PEG dla komórek HeLa i L929 po 24 h hodowli zostały obliczone i podsumowane (Tabela 1), sugerując, że monomery na bazie PEG są znacznie bardziej toksyczne dla komórek niż oligomery PEG, a mPEGA ma najwyższą cytotoksyczność. Generowanie ROS i spadek GSH w komórkach, dwa główne mechanizmy cytotoksyczności, były zatem analizowane w celu zbadania możliwej przyczyny cytotoksyczności.

Tabela 1 Wartości IC50 (mg mL-1) dla oligomerów PEG, monomerów na bazie PEG do komórek HeLa i L929
TEG PEG-400 PEG-1000 PEG-2000 PEG-4000 mPEGMA-500 mPEGMA-950 mPEGA-480
Komórki HeLa 19.8 32,5 36,2 38,2 29,6 4,7 20,8 0,2
Komórki L929 12,4 24.7 22.5 28.7 20.0 5.3 21.7 0.1

3.3.1 Generowanie ROS. Reaktywne formy tlenu (ROSs) są formami chemicznymi zawierającymi tlen w komórce tlenowej, w tym tlen singletowy, rodnik hydroksylowy, nadtlenek i nadtlenki itp.,44 które są naturalnymi produktami metabolizmu wewnątrzkomórkowego i odgrywają ważną rolę w sygnalizacji komórkowej i innych funkcjach. Generalnie wewnątrzkomórkowy poziom ROS jest zrównoważony, ale może drastycznie wzrosnąć w warunkach stresu środowiskowego, prowadząc do apoptozy komórek. Generowanie ROS jest często uważane za jedną z najbardziej możliwych przyczyn cytotoksyczności wielu materiałów biomedycznych.45-51 Tak więc, poziomy ROS indukowane przez TEG i mPEGA-480 były mierzone odpowiednio w bieżących badaniach za pomocą testu DCFH-DA.

Komórki L929 były inkubowane z TEG, a poziomy ROS w różnych punktach czasowych (0, 0,5, 1,0, 1,5, 2 h) zostały wykryte zgodnie z naszymi poprzednimi raportami i pokazane na Rys. 7. Jako przykład, poziomy ROS po inkubacji z różnym stężeniem TEG przez 2 h zostały pokazane na Rys. 7A. Wyraźnie widać, że poziom ROS utrzymywał się na stałym poziomie przy niskim stężeniu TEG (≤2 mg mL-1), ale znacznie wzrastał, gdy stężenie TEG było wyższe niż 2 mg mL-1, zgodnie z wynikiem eksperymentu żywotności komórek na Rys. 2B. Podobnie, rysunki poziomu ROS vs. stężenie TEG w różnych punktach czasowych zostały narysowane i połączone w celu uzyskania mapy 3D (Rys. 7B). Maksymalny poziom ROS stwierdzono po 2 h z 20 mg mL-1 TEG, wykryto około 400% wzrost poziomu ROS w stosunku do kontroli (poziom ROS = 100), co skutkowało najjaśniejszą intensywnością fluorescencji. Wyniki te sugerują, że generowanie ROS jest możliwym mechanizmem cytotoksyczności TEG, a wysoki poziom ROS indukowany przez TEG może być główną przyczyną apoptozy komórek.

image file: c7ra00861a-f7.tif

Rys. 7 Generacja ROS z komórek L929 przez hydrolizę DCFH-DA po inkubacji z TEG przez 2 h (A) i przez wiele czasów (B).

Badano również poziomy ROS indukowane przez mPEGA-480 po 2 h (Rys. 8A). W odróżnieniu od TEG, mPEGA nie powodowała szybkiego wzrostu ROS w komórkach, dopiero ∼170% wzrost ROS w stosunku do kontroli był obserwowany jako maksymalny. Poziom ROS 3D vs. czas mPEGA & (Fig. 8B) pokazał poziom ROS indukowany przez mPEGA-480 jako falę, a grzbiet pojawił się przy umiarkowanym stężeniu mPEGA (5 mg mL-1), nie można zaobserwować znaczącego generowania ROS, co sugeruje, że generowanie ROS może tylko częściowo przyczyniać się do cytotoksyczności mPEGA-480.

image file: c7ra00861a-f8.tif

Rys. 8 Generacja ROS z komórek L929 przez hydrolizę DCFH-DA po inkubacji z mPEGA-480 przez 2 h (A) i przez wiele czasów (B).

3.3.2 Spadek GSH. Zredukowany glutation (GSH) jest trójpeptydem zawierającym glutaminę, cysteinę i glicynę. Jest on ważnym antyoksydantem u zwierząt, roślin i niektórych bakterii. W procesie tym zredukowany glutation jest przekształcany w utleniony glutation (GSSG), dwie cząsteczki glutationu połączone wiązaniem disulfidowym. Obniżony poziom wewnątrzkomórkowego GSH może powodować wzrost poziomu wewnątrzkomórkowych ROS, co może prowadzić do cytotoksyczności. Dlatego też spadek GSH jest również uważany za jeden z możliwych mechanizmów cytotoksyczności. W obecnych badaniach, do pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu GSH zastosowano test DNTB. Poziom GSH w komórkach L929 analizowano po inkubacji komórek z TEG lub mPEGA-480 przez 1 h, a komórki w czystym medium hodowlanym (100%) badano jako kontrolę (ryc. 9). Nie zaobserwowano znaczącego spadku GSH, gdy komórki były inkubowane z TEG, co sugeruje, że spadek GSH może nie być przyczyną cytotoksyczności TEG. Przeciwnie, gdy mPEGA-480 był inkubowany z komórkami, nawet w niskim stężeniu (1 mg mL-1), obserwowano gwałtowny spadek wartości GSH (∼40%). Wraz ze wzrostem stężenia mPEGA-480 poziom GSH szybko spadał niemal do zera, co sugeruje, że cytotoksyczność mPEGA-480 może wynikać głównie z obniżonego poziomu GSH.

image file: c7ra00861a-f9.tif

Rys. 9 Spadek GSH w komórkach L929 metodą DNTB assay po inkubacji komórek z TEG i mPEGA-480.

Redukująca grupa tiolowa w GSH jest ważnym źródłem antyoksydacyjnym w organizmach. Możliwy mechanizm cytotoksyczności mPEGA-480 przypisuje się reakcji addycji Michaela pomiędzy grupą tiolową a wiązaniem winylowym, co prowadzi do naruszenia wewnątrzkomórkowej równowagi redoks i apoptozy komórek. Wcześniejsze badania sugerowały, że reakcja addycji Michaela między tiolem i akrylanem jest znacznie szybsza niż między tiolem i metakrylanem,52 co może być uzasadnioną przyczyną różnej ostrej cytotoksyczności między mPEGA-480 i mPEGMA-500.

Wnioski

Po raz pierwszy oceniono cytotoksyczność oligomerów PEG i monomerów na bazie PEG w stosunku do komórek HeLa i L929. Potwierdzono zależną od stężenia cytotoksyczność oligomerów PEG i monomerów na bazie PEG, którą przedstawiono jako wartości IC50 w stosunku do komórek HeLa i L929. PEG-400, PEG-2000 w obecnych badaniach wydają się prawie niecytotoksyczne. PEG-1000, PEG-4000 i mPEGMA-950 wykazywały umiarkowaną cytotoksyczność, zwłaszcza w wysokich stężeniach. TEG i mPEGMA-500 wykazały znaczną cytotoksyczność, a mPEGA-480 – ostrą cytotoksyczność. Ponadto, typy komórek również wpływają na wyniki badań cytotoksyczności, komórki HeLa są bardziej odporne na tolerancję pochodnych PEG niż komórki L929. Te wyniki dotyczące cytotoksyczności pochodnych PEG są wstępne, ale fundamentalne dla ich przyszłego zastosowania biomedycznego, więcej informacji na temat odpowiedzi komórek i zachowania wobec innych pochodnych PEG będzie dalej badane.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez National Science Foundation of China (21574073, 21534006).

  1. M. V. Cleveland, D. P. Flavin, R. A. Ruben, R. M. Epstein i G. E. Clark, South. Med. J., 2001, 94, 478-481 CrossRef CAS PubMed.
  2. J. A. DiPalma, M. V. B. Cleveland, J. McGowan i J. L. Herrera, Am. J. Gastroenterol., 2007, 102, 1436-1441 CrossRef CAS PubMed.
  3. B. A. Erickson, J. C. Austin, C. S. Cooper and M. A. Boyt, J. Urol., 2003, 170, 1518-1520 CrossRef CAS PubMed.
  4. J. L. Cleland, S. E. Builder, J. R. Swartz, M. Winkler, J. Y. Chang and D. I. C. Wang, Bio/Technology, 1992, 10, 1013-1019 CrossRef CAS PubMed.
  5. Z. Liu, J. T. Robinson, X. M. Sun and H. J. Dai, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 10876-10877 CrossRef CAS PubMed.
  6. J. M. Harris and R. B. Chess, Nat. Rev. Drug Discovery, 2003, 2, 214-221 CrossRef CAS PubMed.
  7. F. M. Veronese i G. Pasut, Drug Discovery Today, 2005, 10, 1451-1458 CrossRef CAS PubMed.
  8. M. J. Roberts, M. D. Bentley i J. M. Harris, Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476 CrossRef CAS PubMed.
  9. F. M. Veronese, Biomaterials, 2001, 22, 405-417 CrossRef CAS PubMed.
  10. H. Zhang, T. Zhao, P. Duffy, Y. Dong, A. Ni Annaidh, E. O’Cearbhaill and W. Wang, Adv. Healthcare Mater., 2015, 4, 2260-2268 CrossRef CAS PubMed.
  11. Y. Dong, Y. Qin, M. Dubaa, J. Killion, Y. Gao, T. Zhao, D. Zhou, D. Duscher, L. Geever, G. C. Gurtner and W. Wang, Polym. Chem., 2015, 6, 6182-6192 RSC.
  12. T. M. Allen, C. Hansen, F. Martin, C. Redemann and A. Yauyoung, Biochim. Biophys. Acta, Biomembr., 1991, 1066, 29-36 CrossRef CAS.
  13. Y. L. Zhang, L. Tao, S. X. Li and Y. Wei, Biomacromolecules, 2011, 12, 2894-2901 CrossRef CAS PubMed.
  14. Y. L. Zhang, B. Yang, L. X. Xu, X. Y. Zhang, L. Tao and Y. Wei, Acta Chim. Sin., 2013, 71, 485-492 CrossRef CAS.
  15. C. C. Luo, Y. H. Zhang, X. W. Zeng, Y. W. Zeng and Y. G. Wang, J. Colloid Interface Sci., 2005, 288, 444-448 CrossRef CAS PubMed.
  16. S. Dhar, F. X. Gu, R. Langer, O. C. Farokhzad and S. J. Lippard, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2008, 105, 17356-17361 CrossRef CAS PubMed.
  17. J. Manson, D. Kumar, B. J. Meenan and D. Dixon, Gold Bull, 2011, 44, 99-105 CrossRef CAS.
  18. X. Y. Zhang, C. K. Fu, L. Feng, Y. Ji, L. Tao, Q. Huang, S. X. Li and Y. Wei, Polymer, 2012, 53, 3178-3184 CrossRef CAS.
  19. X. Y. Zhang, J. F. Hui, B. Yang, Y. Yang, D. D. Fan, M. Y. Liu, L. Tao and Y. Wei, Polym. Chem., 2013, 4, 4120-4125 RSC.
  20. D. Bontempo i H. D. Maynard, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 6508-6509 CrossRef CAS PubMed.
  21. K. L. Heredia, Z. P. Tolstyka and H. D. Maynard, Macromolecules, 2007, 40, 4772-4779 CrossRef CAS.
  22. H. Hussain, K. Y. Mya and C. He, Langmuir, 2008, 24, 13279-13286 CrossRef CAS PubMed.
  23. J. P. Magnusson, S. Bersani, S. Salmaso, C. Alexander and P. Caliceti, Bioconjugate Chem., 2010, 21, 671-678 CrossRef CAS PubMed.
  24. F. J. Xu, Y. L. Li, E. T. Kang and K. G. Neoh, Biomacromolecules, 2005, 6, 1759-1768 CrossRef CAS PubMed.
  25. L. L. Yu, L. Yao and K. Yang, J. Porous Mater., 2016, 23, 1581-1589 CrossRef CAS.
  26. S. Yuan, D. Wan, B. Liang, S. O. Pehkonen, Y. P. Ting, K. G. Neoh and E. T. Kang, Langmuir, 2011, 27, 2761-2774 CrossRef CAS PubMed.
  27. S. A, Q. Xu, D. Zhou, Y. Gao, J. M. Vasquez, U. Greiser, W. Wang, W. Liu and W. Wang, Polym. Chem., 2017, 8, 1283-1287 RSC.
  28. H. F. Smyth, C. P. Carpenter i C. S. Weil, J. Am. Pharm. Assoc., 1950, 39, 349-354 CrossRef CAS.
  29. H. F. Smyth, C. P. Carpenter and C. S. Weil, J. Am. Pharm. Assoc., 1955, 44, 27-30 CrossRef CAS.
  30. D. E. Prentice and S. K. Majeed, Toxicol. Lett., 1978, 2, 119-122 CrossRef CAS.
  31. H. Tominaga, M. Ishiyama, F. Ohseto, K. Sasamoto, T. Hamamoto, K. Suzuki and M. Watanabe, Anal. Commun., 1999, 36, 47-50 RSC.
  32. Y. Li, Y. Zhang, F. Shi, L. Tao, Y. Wei and X. Wang, Colloids Surf., B, 2016, 149, 168-173 CrossRef PubMed.
  33. B. Yang, Y. Zhang, X. Zhang, L. Tao, S. Li and Y. Wei, Polym. Chem., 2012, 3, 3235-3238 RSC.
  34. H. Wang i J. A. Joseph, Free Radical Biol. Med., 1999, 27, 612-616 CrossRef CAS PubMed.
  35. I. K. Smith, T. L. Vieweller and C. A. Thorne, Anal. Biochem., 1988, 175, 408-413 CrossRef CAS PubMed.
  36. I. Rahman, A. Kode and S. K. Biswas, Nat. Protoc., 2006, 1, 3159-3165 CrossRef CAS PubMed.
  37. R. Jevprasesphant, J. Penny, R. Jalal, D. Attwood, N. B. McKeown and A. D’Emanuele, Int. J. Pharm., 2003, 252, 263-266 CrossRef CAS PubMed.
  38. A. K. Gupta and S. Wells, IEEE Trans. Nanobioscience, 2004, 3, 66-73 CrossRef PubMed.
  39. D. Luo, K. Haverstick, N. Belcheva, E. Han and W. M. Saltzman, Macromolecules, 2002, 35, 3456-3462 CrossRef CAS.
  40. C. W. Chang, E. Bays, L. Tao, S. N. S. Alconcel and H. D. Maynard, Chem. Commun., 2009, 3580-3582 RSC.
  41. B. D. Fairbanks, P. A. Gunatillake and L. Meagher, Adv. Drug Delivery Rev., 2015, 91, 141-152 CrossRef CAS PubMed.
  42. T. Zhou, Y. Zhu, X. Li, X. Liu, K. W. K. Yeung, S. Wu, X. Wang, Z. Cui, X. Yang and P. K. Chu, Prog. Mater. Sci., 2016, 83, 191-235 CrossRef CAS.
  43. K. H. Jones and J. A. Senft, J. Histochem. Cytochem., 1985, 33, 77-79 CrossRef CAS PubMed.
  44. M. Hayyan, M. A. Hashim and I. M. AlNashef, Chem. Rev., 2016, 116, 3029-3085 CrossRef CAS PubMed.
  45. A. Lankoff, W. J. Sandberg, A. Węgierek-Ciuk, H. Lisowska, M. Refsnes, B. Sartowska, P. E. Schwarze, S. Męczyńska-Wielgosz, M. Wojewodzka and M. Kruszewski, Toxicol. Lett., 2012, 208, 197-213 CrossRef CAS PubMed.
  46. Y. Chang, S.-T. Yang, J.-H. Liu, E. Dong, Y. Wang, A. Cao, Y. Liu and H. Wang, Toxicol. Lett., 2011, 200, 201-210 CrossRef CAS PubMed.
  47. X. Cai, J. Hao, X. Zhang, B. Yu, J. Ren, C. Luo, Q. Li, Q. Huang, X. Shi, W. Li i J. Liu, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2010, 243, 27-34 CrossRef CAS PubMed.
  48. S. J. Park, Y. C. Park, S. W. Lee, M. S. Jeong, K.-N. Yu, H. Jung, J.-K. Lee, J. S. Kim and M.-H. Cho, Toxicol. Lett., 2011, 207, 197-203 CrossRef CAS PubMed.
  49. K. Pulskamp, S. Diabate and H. F. Krug, Toxicol. Lett., 2007, 168, 58-74 CrossRef CAS PubMed.
  50. A. M. Studer, L. K. Limbach, L. Van Duc, F. Krumeich, E. K. Athanassiou, L. C. Gerber, H. Moch and W. J. Stark, Toxicol. Lett., 2010, 197, 169-174 CrossRef CAS PubMed.
  51. T. Thurnherr, C. Brandenberger, K. Fischer, L. Diener, P. Manser, X. Maeder-Althaus, J.-P. Kaiser, H. F. Krug, B. Rothen-Rutishauser i P. Wick, Toxicol. Lett., 2011, 200, 176-186 CrossRef CAS PubMed.
  52. G. Li, R. K. Randev, A. H. Soeriyadi, G. Rees, C. Boyer, Z. Tong, T. P. Davis, C. R. Becer and D. M. Haddleton, Polym. Chem., 2010, 1, 1196-1204 RSC.

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.