Degenerate codon mixing for PCR-based manipulation of highly repetitive sequences

Wyniki i dyskusja

Test 'autophagic flux’ opisany w Jiang et al. jest ilościowym testem reporterowym z użyciem zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), który mierzy zmiany ratiometryczne polyQ-GFP do wolnego GFP poprzez analizę Western blot. Multicystronowy konstrukt reporterowy został zaprojektowany tak, aby kodował dwa białka: polyQ połączone z N-końcowym GFP i wolne GFP. Wirusowa sekwencja 2A (v2A) została umieszczona jako region łączący pomiędzy sekwencjami kodującymi dwa białka, aby umożliwić stechiometryczną translację dwóch oddzielnych białek z jednej otwartej ramki odczytu (Rys. 1a) .

Zaprojektowaliśmy sekwencję polyQ zawierającą 80 powtórzeń glutaminowych (Q80). Sekwencja została zaprojektowana tak, aby miała niskie podobieństwo powtórzeń poprzez losowe przeplatanie tripletów CAG kodujących glutaminę z tripletami CAA kodującymi glutaminę (Rys. 1b, c). Substytucje nukleotydów były dokonywane na oko, aby wygenerować półprzypadkowy wzór. Ta nierepetycyjna konstrukcja sekwencji powinna nie tylko zwiększyć stabilność sekwencji podczas rozmnażania w bakteriach, ale także umożliwić zaprojektowanie starterów PCR, które annealują do specyficznych regionów sekwencji.

Opisany powyżej konstrukt Q80-GFP-v2A-GFP został zsyntetyzowany komercyjnie (Biomatik Corporation) (patrz plik dodatkowy 1) i podklonowany przez miejsca restrykcyjne BamHI i ClaI do opartego na transpozonie Tol2 wektora transferu genów pT2AL200R150G (zwanego dalej Tol2) dostępnego w laboratorium Kawakami (Fig. 1a i zobacz plik dodatkowy 2).

Konstrukty PolyQ z mniejszą liczbą powtórzeń glutaminowych zostały wygenerowane poprzez amplifikację wykluczającą metodą PCR konstruktu Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. Startery zostały zaprojektowane tak, aby amplifikować wokół wektora z wyłączeniem określonej liczby powtórzeń glutaminowych w celu wygenerowania interesujących nas konstruktów (Rys. 1d-f). Naszym celem było wygenerowanie wektorów z około 52 (Q52), 31 (Q31) i 10 (Q10) powtórzeniami glutaminowymi. Wektory Q52 i Q31 zostały wygenerowane przy użyciu tego samego primera odwrotnego połączonego z różnymi primerami forward. Ten wspólny primer odwrotny amplifikował 2 powtórzenia glutaminowe, podczas gdy primery forward amplifikowały dodatkowe 50 i 29 powtórzeń glutaminowych potrzebnych do wygenerowania wektorów Q52 i Q31, odpowiednio. Pozycja primera odwrotnego została nieznacznie przesunięta w celu optymalizacji amplifikacji wektora przypuszczalnego Q10, tak że primer odwrotny amplifikował teraz 5 powtórzeń glutaminowych, podczas gdy primer forward amplifikował pozostałe 5 powtórzeń glutaminowych (Rys. 1d-f). Dzięki zastosowaniu rygorystycznych temperatur annealingu w reakcji PCR uzyskaliśmy specyficzne wiązanie primera. Wyekstrahowane i oczyszczone w żelu produkty PCR poddano fosforylacji, kolokalizacji przez auto-ligację, a następnie transformacji do komórek kompetentnych (patrz plik dodatkowy 3). PCR z użyciem starterów flankujących region polyQ wykazała w przybliżeniu oczekiwane rozmiary produktów dla zamierzonych wektorów putatywnych Q52, Q31 i Q10 (Rys. 1g). Wygenerowane konstrukty zostały poddane sekwencjonowaniu w celu ustalenia, czy oczekiwana liczba powtórzeń polyQ jest obecna. Podczas gdy konstrukt Q52 miał oczekiwaną liczbę powtórzeń glutaminowych (Rys. 2a, b), sekwencjonowanie ujawniło niewielkie rozbieżności z oczekiwaną liczbą powtórzeń polyQ dla dwóch pozostałych konstruktów, gdzie wektor Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP miał 21 powtórzeń glutaminowych (zwany dalej Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (Rys. 2c, d), a Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP miał 21 powtórzeń glutaminowych (Rys. 2c, d). 2c, d), a wektor Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP miał powtórzenia 11-glutaminowe (dalej Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (Rys. 2e, f). Dalsza analiza wykazała, że wygenerowana sekwencja Q21 pochodziła bezpośrednio z oryginalnej sekwencji, a utrata powtórzeń glutaminowych była spowodowana wiązaniem przez primer forward Q31 30 bp w dół od przewidywanego miejsca wiązania. W przeciwieństwie do tego, dodatkowe powtórzenie glutaminowe w sekwencji Q11 zostało wygenerowane de novo, dodanie kodonu CAA.

Aby zbadać kinetykę agregacji i „strumień autofagiczny” białka polyQ in vivo, wstrzyknęliśmy wygenerowane wektory polyQ (25 ng/μL) i mRNA transpozazy (25 ng/μL) do grup jednokomórkowych zarodków zebrafish (Rys. 3a, b). Dla każdej grupy przeprowadzono analizę Western blot z przeciwciałem anty-GFP w lizatach zarodków 24 h po zapłodnieniu (hpf) (10 zarodków na próbkę). Pusty wektor Tol2 (25 ng/μL) i transpozazowe mRNA (25 ng/μL) wstrzykiwane i niewstrzykiwane zarodki były włączone jako kontrole. Zarodki, którym wstrzyknięto konstrukty polyQ, wytworzyły dwa pasma wykryte przez przeciwciało anty-GFP, zgodnie z oczekiwaniami; GFP przyłączone do polyQ (polyQ80-GFP przy ~ 48 kDa, polyQ52-GFP przy ~ 38 kDa, polyQ21-GFP przy ~ 33 kDa i polyQ11-GFP przy ~ 31 kDa) oraz wolne GFP (~ 27 kDa) (Rys. 3c). Każdy z lizatów zarodków wyrażających konstrukt polyQ-GFP wykazywał również słabsze pasmo o wyższej wielkości białka, odpowiadające pełnej długości konstruktu polyQX-GFP-v2A-GFP (polyQ80-GFP-v2A-GFP przy ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP przy ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP przy ~ 60 kDa i polyQ11-GFP-v2A-GFP przy ~ 58 kDa). To pasmo reprezentuje ~ 10% całkowitego białka, które jest tłumaczone jako pojedyncze, pełnowartościowe białko przy użyciu systemu sekwencji v2A. Stosunki Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP i Q11-GFP:GFP wynoszą odpowiednio ~ 5, ~ 4, ~ 2 i ~ 1 (Rys. 3d). Ponieważ sekwencja v2A pozwala na stechiometryczną translację białek polyQ-GFP i GFP, teoretycznie stosunek polyQ-GFP:GFP powinien wynosić 1. Zaobserwowane większe proporcje mogą wskazywać na akumulację tych białek. Obserwacje te są zgodne z literaturą, gdzie wykazano, że konstrukty fuzyjne polyQ-GFP zawierające więcej niż 19 reszt glutaminowych agregują się w transfekowanych komórkach w sposób zależny od długości. Obserwacje te prowadzą nas do wniosku, że nasze konstrukty Tol2-QX-GFP-v2A-GFP stanowią użyteczne narzędzie do badania „przepływu autofagicznego” in vivo w modelu larwalnym zebrafish.

Wniosek

W podsumowaniu to badanie dostarcza solidnego i łatwo adoptowalnego rozwiązania do generowania bliskich zamierzonych długości powtórzeń polyQ. W celu wygenerowania dokładnej liczby powtórzeń glutaminowych można przeprowadzić kolejne rundy amplifikacji ze zmienionymi sekwencjami starterów. Dodatkowo, długość primera może być zwiększona w celu zwiększenia specyficzności annealingu primera do matrycy. Nasza technika ma kilka zalet w stosunku do istniejących metod amplifikacji regionów repetytywnych opartych na PCR i ma na celu zminimalizowanie generowania niespecyficznych produktów PCR oraz wadliwych powtórzeń poprzez wykorzystanie redundancji kodonów w kodzie genetycznym do generowania synonimicznej sekwencji kodującej DNA o zredukowanej liczbie powtórzeń. Ponadto, nasze podejście nie jest ograniczone do generowania sekwencji powtórzeń polyQ, ale może być również uogólnione do generowania innych sekwencji powtórzeń nukleotydowych. Co więcej, nasza metoda jest stosunkowo tania, ponieważ tylko początkowy konstrukt polyQ80-GFP-v2A-GFP wymaga komercyjnej syntezy, której koszt zależy od ceny za bazę nukleotydową, długości, czystości i masy. Wszystkie inne wymagane materiały są standardowymi odczynnikami używanymi do klonowania molekularnego. Podsumowując, opisana technika zapewnia łatwe do zaadoptowania, niedrogie rozwiązanie do generowania powtarzających się kodujących sekwencji DNA, które mogą być manipulowane zgodnie z wymaganiami.

.