Znalezienie skutecznego sposobu hamowania odrzutów immunologicznych jest jedną z najważniejszych strategii wspomagania klinicznych transplantacji. Ostatnio badania dotyczące przeszczepiania narządów wykazały, że zastosowanie inhibitora DPPIV lub mAb anty-CD26 zwiększyło odpowiednio engraftment komórek dawcy i zmniejszyło ostrą GVHD, i wskazało CD26 jako nowy cel interwencji terapeutycznej w chorobie GVHD.11 Aby wyjaśnić rolę CD26 w odrzucaniu przeszczepu allogenicznego, myszy z nokautem CD26 zostały użyte w badaniu allogenicznego przeszczepu skóry. Stwierdziliśmy, że myszy CD26-/- prezentowały niższy stopień martwicy przeszczepów i opóźnione odrzucanie alloprzeszczepu (ryc. 1).
CD26 jest markerem aktywacji limfocytów T i B oraz komórek NK. Jako cząsteczka kostymulująca, CD26 pośredniczy w procesach transdukcji sygnału komórek T poprzez interakcję z deaminazą adenozyny, CD45, kaweoliną-1 lub CARMA1.5 Zablokowanie ko-stymulacji komórek T pośredniczonej przez CD26 indukowało anergię komórek T CD4+.24 W obecnej pracy stwierdzono mniejszy odsetek komórek CD3+, jak również komórek CD4+, w MPBLs i MSLs myszy CD26-/- zarówno przed, jak i po przeszczepieniu skóry (ryc. 3). Ponadto, infiltracja komórek CD3+ i CD4+ była wykrywana w mniejszym stopniu w tkankach przeszczepu myszy CD26-/- niż u myszy CD26+/+ po przeszczepie skóry (Fig. 7b, c). To odkrycie wskazuje, że niedobór CD26 powoduje upośledzenie rozwoju, dojrzewania i funkcji komórek CD4+, co odpowiada naszym wcześniejszym odkryciom.23 Co ciekawe, odsetek komórek CD8+ w MPBL myszy CD26-/- był taki sam jak u myszy CD26+/+ przed przeszczepem; jednak odsetek ten był znacznie niższy u myszy CD26-/- niż u myszy CD26+/+ po przeszczepie skóry (ryc. 3). Liczba infiltracji komórek CD8+ w przeszczepach skóry była wyraźnie niższa u myszy CD26-/- niż u myszy CD26+/+ po przeszczepie skóry. Wyniki te sugerują zmniejszoną proliferację, aktywację i funkcję komórek CD8+ u myszy CD26-/- w odpowiedzi na antygeny allogeniczne. Komórki T CD8+ są głównym składnikiem repertuaru allogenicznych komórek T indukowanego po przeszczepie allogenicznym u myszy; ich aktywność cytotoksyczna jest skierowana na peptydy głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I.25 Zmniejszony odsetek komórek CD8+ u myszy CD26-/- (ryc. 3) po przeszczepie allogenicznym może częściowo przyczynić się do zmniejszenia stopnia martwicy przeszczepów i opóźnionego odrzucania alloprzeszczepu. Ponadto odsetek komórek CD3+, CD4+ i CD4+NK1.1- w MSLs był niższy u myszy CD26-/- niż u myszy CD26+/+ przed przeszczepem, ale różnica ta została zmniejszona po przeszczepie. Stwierdzono, że zahamowanie CD26 zwiększa naprowadzanie komórek dawcy i poprawia allogeniczny engraftment.26 Zmniejszenie różnicy procentowej komórek CD3+ i CD4+ MSLs między dwoma typami myszy po transplantacji może być spowodowane zwiększonym naprowadzaniem tych komórek do śledziony u myszy CD26-/-.
Odrzucanie alloprzeszczepu jest głównie napędzane przez komórki T gospodarza. Podczas gdy wszystkie elementy wrodzonego i adaptacyjnego układu odpornościowego biorą udział w odrzucaniu przeszczepu, limfocyty T, a w szczególności komórki CD4+, mają największe znaczenie w tym procesie.27 Po aktywacji, komórki T CD4+ głównie kierują postępem odpowiedzi poprzez wydzielanie cytokin, które aktywują, rozszerzają i/lub rekrutują inne komórki efektorowe, takie jak makrofagi, komórki T CD8+ i komórki B.27, 28 Poprzez dalszą analizę poziomów cytokin u obu typów myszy, stwierdzono znacznie zmniejszone wydzielanie IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-17, IL-4, i IL-13 w surowicy myszy CD26-/- po przeszczepie allogenicznym (ryc. 4). To zmniejszone wydzielanie mogło być spowodowane mniejszą liczbą komórek CD4+ u myszy CD26-/- przed transplantacją; należy jednak wziąć pod uwagę upośledzone różnicowanie i funkcję komórek CD4+ w odpowiedzi na antygen allogeniczny u myszy CD26-/-. Niskie poziomy IL-2, IFN-γ i IL-6 w surowicy wskazują na częściowo wadliwe różnicowanie i funkcję komórek Th1, podczas gdy niskie poziomy IL-4 i IL-13 wskazują na niewystarczające różnicowanie i funkcję komórek Th2 u myszy CD26-/-.
Jako kluczowa cytokina, IFN-γ wykazuje różnorodne i potencjalnie sprzeczne efekty na odrzucanie przeszczepu narządowego.29 IL-2 jest inną cytokiną związaną z Th1, która również ma złożony wpływ na odrzucanie alloprzeszczepu.30 Zarówno IFN-γ, jak i IL-2 są cytokinami plejotropowymi i odgrywają ważną rolę w proliferacji komórek T i B podczas reakcji zapalnej. Cytokiny te najpierw działają jako cząsteczki inicjujące wzrost komórek T i przeżywają podczas odpowiedzi immunologicznej, a następnie wzmacniają odpowiedź Th1 z dodatnim sprzężeniem zwrotnym.29, 30 W ostrym odrzucaniu, komórki Th1 przeważnie infiltrują do przeszczepów, w których IL-2 i IFN-γ mogą indukować aktywację komórek NK i makrofagów, które są silną bronią do niszczenia alloprzeszczepów.29, 30 Ponadto IFN-γ indukuje ekspresję cząsteczek MHC klasy II i wydzielanie IgG2a i IgG3 z aktywowanych komórek B. W modelu ostrego odrzucania myszy IFN-γ-/- wykazywały opóźnione odrzucanie przeszczepu skóry.31 W kilku badaniach stwierdzono, że w tolerancji na odrzucanie alloprzeszczepu przynajmniej częściowo pośredniczy IL-4, cytokina typowa dla komórek Th2, poprzez promowanie produkcji IL-10 i IgG1.32 Inne badania dostarczyły sprzecznych wyników, wskazując, że podawanie inhibitora Th2 wydłuża przeżycie alloprzeszczepu serca.33 IL-13, która wykazuje działanie podobne do IL-4, jest kolejną cytokiną związaną z odpowiedzią Th2; IL-13 ma wspólny łańcuch receptorowy (IL-4R α-chain) z IL-4, ale różni się pod względem zaangażowanych komórek docelowych, co powoduje szereg różnych zdarzeń biologicznych.32 W coraz większej liczbie badań wykazano, że cytokiny zarówno komórek Th1, jak i Th2, takie jak IL-2, IFN-γ i IL-4, są zdolne do wspierania ekspansji klonalnej komórek B i syntezy przeciwciał.28, 34 Niedobór CD26 powoduje upośledzenie różnicowania i funkcji komórek Th1 i Th2 u myszy CD26-/-. Niski poziom cytokin Th1 IFN-γ i IL-2 może skutkować zmniejszeniem proliferacji komórek CD8+ (ryc. 3) i aktywacji makrofagów, zmniejszając w ten sposób infiltrację komórek CD8+ i makrofagów do przeszczepów (ryc. 7) podczas odrzucania alloprzeszczepu. Z drugiej strony, niskie poziomy IFN-γ, IL-2 i IL-4 u myszy CD26-/- po przeszczepie allogenicznym mogą upośledzać aktywację i różnicowanie komórek B, zmniejszając produkcję przeciwciał (ryc. 2).
Odrzucanie immunologiczne jest złożonym procesem, który obejmuje komórkową, jak również humoralną odpowiedź immunologiczną i charakteryzuje się produkcją przeciwciał przez limfocyty B. IgG, główny składnik IgG w surowicy i powszechne patogenne przeciwciało u pacjentów z odrzucaniem przeszczepu, odgrywa niezbędną rolę w uszkadzaniu przeszczepów podczas odrzucania przeszczepu.35 W naszej obecnej pracy wykryto niską produkcję IgG i jej podgrup, IgG1 i IgG2a, w surowicy myszy CD26-/- (ryc. 2). Wynik ten odpowiada naszym wcześniejszym ustaleniom wykazującym, że produkcja przeciwciał była wyraźnie niższa u myszy CD26-/- niż u myszy CD26+/+ zarówno po immunizacji owalbuminą, jak i po stymulacji mitogenem pokeweed.23, 36 To odkrycie wskazuje, że różnicowanie komórek B było upośledzone przez niedobór CD26. W aktywacji komórek B zależnej od komórek T, interakcja między komórkami B i komórkami Th oraz pewne cytokiny Th1 i Th2 są wymagane do wspierania ekspansji klonalnej komórek B i syntezy przeciwciał. U myszy CD26-/-, niski odsetek komórek Th (CD4+) (ryc. 3) oraz niska produkcja IL-2 i IL-4 (ryc. 4) mogą prowadzić do upośledzenia aktywacji i różnicowania komórek B, zmniejszając w ten sposób produkcję IgG. IgG jest głównym składnikiem, który pośredniczy w alloregulacji między egzogennymi antygenami a komórkami CD8+ biorcy podczas odrzucania przeszczepu.37 Niska produkcja IgG u myszy CD26-/- (ryc. 2) może zatem skutkować zmniejszeniem ataku przeszczepu przez komórki efektorowe.
Co ciekawe, poziom wydzielania IL-10 był wyższy u myszy CD26-/- (ryc. 4G). Wspierając nasze wyniki, wykazano, że blokada CD26/DPPIV poprawia przeszczep alloprzeszczepu płuc i zwiększa ekspresję IL-10.38 IL-10 jest znana jako cytokina przeciwzapalna; IL-10 została zgłoszona jako zmniejszająca ekspresję cytokin Th1 i Th17 w procesie zapalenia, szczególnie podczas sygnalizacji komórek Treg.39 Różne typy komórek produkują IL-10, w tym Th2 i makrofagi, a także limfocyty T regulatorowe.40 U myszy CD26-/- wysoki poziom wydzielania IL-10 (ryc. 4g) mógł być wynikiem wysokiego odsetka Tregs (ryc. 6). Co istotne, w odpowiedzi na przeszczep allogeniczny, wysoki poziom IL-6 wykryto w surowicy myszy CD26+/+ od pierwszego dnia i osiągnął on szczyt w 7 dniu po przeszczepie; natomiast tylko niewielka ilość IL-6 została wykryta w surowicy myszy CD26-/- do 7 dnia po przeszczepie (ryc. 4d). Ostatnie badania wykazały, że IL-6 odgrywa bardzo ważną rolę w regulacji równowagi między komórkami Th17 produkującymi IL-17 a Tregs.41 Tak więc niski poziom IL-17 i wysoki odsetek Tregs obserwowany u myszy CD26-/- w tym badaniu (ryc. 5 i 6) mógł być częściowo spowodowany zmniejszoną funkcją IL-6 i nadmierną aktywnością IL-10.
Ponadto doniesiono, że ludzkie komórki Th17 charakteryzują się wysoką ekspresją CD26,18 która jest negatywnym markerem selekcyjnym dla ludzkich Tregs,19 sugerując, że CD26 jest zaangażowany w różnicowanie i funkcję komórek Th17, ale nie jest związany z Tregs. Dlatego nie jest zaskakujące, że u myszy CD26-/- zaobserwowano zaburzoną równowagę różnicowania Th17 i Tregs. Chociaż odrzucanie przeszczepu tradycyjnie wiąże się z różnicowaniem Th1, wiele ostatnich badań wykazało, że komórki Th17 i IL-17 były ściśle związane z odrzucaniem przeszczepu.42 Komórki Th17 są nowszym dodatkiem do paradygmatu komórek T, podczas gdy IL-17, kluczowa cytokina Th17, jest czynnikiem prozapalnym.43 Gromadzące się dowody sugerują, że komórki Th17 odgrywają rolę w rozwoju przewlekłego uszkodzenia alloprzeszczepu w transplantacji różnych narządów. Cechą charakterystyczną odrzucania przeszczepu indukowanego przez komórki Th17 jest zdolność IL-17 do rekrutacji neutrofili, które są jednymi z pierwszych efektorowych komórek zapalnych zdolnych do infiltracji alloprzeszczepu po transplantacji, powodując w ten sposób uszkodzenie przeszczepu.42 Z kolei Tregs odgrywają kluczową rolę w tolerancji immunologicznej i negatywnej kontroli różnych odpowiedzi immunologicznych poprzez supresję lub obniżenie regulacji innych efektorowych komórek T podczas odrzucania immunologicznego.44 Stwierdzono, że inhibicja CD26/DPPIV promuje wydzielanie TGF-β1, który jest niezbędny do różnicowania Tregs.45 Do rozwoju i funkcji komórek Treg CD4+CD25+ wymagany jest czynnik transkrypcyjny forkhead (Foxp3).46 IL-10 jest ważnym czynnikiem w utrzymaniu ekspresji FoxP3.47 Wysoki poziom IL-10 obserwowany u myszy CD26-/- (ryc. 4g) mógł korzystnie wpłynąć na ekspresję FoxP3. Przypuszcza się, że zmniejszona aktywność Th17 i zwiększony odsetek Tregs w MSLs i MPBLs myszy CD26-/- po przeszczepie allogenicznym są najważniejszą przyczyną zmniejszonej martwicy przeszczepu i opóźnionego odrzucenia alloprzeszczepu u myszy CD26-/-.
Część chemokin przyczynia się do infiltracji makrofagów do tkanek przeszczepu, takich jak białka chemotaktyczne monocytów (MCP-1, -2, -3), czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF lub CSF-1) i ligand chemokinowy 5 (CCL5 lub RANTES (regulated and normal T cell expressed and secreted)).48 Jako substraty DPPIV/CD26, MCP i RANTES mogą ulec skróceniu przez DPPIV, co prowadzi do zmiany ich właściwości chemotaktycznych.3 Stwierdzono, że MCP z amino-końcowym Lys mogą być rozszczepiane przez CD26/DPPIV, co może powodować inaktywację ich chemotaksji; natomiast MCP z NH2-końcowym pGlu pozostają nienaruszone.49 Należy dokładniej zbadać wpływ CD26 na różne izoformy MCP zaangażowane w chemotaksję makrofagów podczas transplantacji skóry. Wykazano, że truncacja CCL5/RANTES przez DPPIV zmniejsza jej wiązanie z receptorem chemokinowym 1 (CCR1) i CCR3, ale zwiększa jej wiązanie z CCR5, przyczyniając się do rekrutacji makrofagów w przeszczepach nerek.48 Niedobór CD26 u myszy CD26-/- prawdopodobnie zmniejszył aktywność wiązania CCL5/RANTES do CCR5 i spowodował zmniejszenie infiltracji makrofagów do przeszczepów.
CD26 jest białkiem wielofunkcyjnym, wykazującym aktywność enzymatyczną lub oddziałującym z różnymi cząsteczkami. Ostatnie badania wykazały, że CD26/DPPIV bierze udział w gojeniu się ran skórnych. U myszy CD26-/- zaobserwowano wyższe wskaźniki zamykania ran, rewaskularyzacji i proliferacji komórek, a inhibitor DPPIV wykazał potencjalne korzyści w gojeniu ran.50 W przypadku przeszczepów skóry, CD26 jest zaangażowany nie tylko w odrzucanie immunologiczne, ale również w proces gojenia się ran; tak więc CD26 odgrywa rolę Janusa w procesie przeszczepiania i odrzucania. W niniejszej pracy poziom martwicy w przeszczepach oraz poziomy IgG i związanych z nimi cytokin w surowicy myszy CD26-/- były znacznie niższe niż u myszy CD26+/+. Jednakże, od 13 dnia po przeszczepie, przeszczepy zostały usunięte, a rany goiły się szybko u myszy CD26-/-. Zmniejszenie odrzucania alloprzeszczepu u myszy CD26-/-, jak zaobserwowano w naszej obecnej pracy, może być częściowo przeciwdziałane przez wzmocnienie gojenia się ran, gdzie CD26 jest zaangażowany w oba procesy.
Podsumowując, nasze wyniki wskazują, że CD26 jest zaangażowany w odrzucanie allogenicznych przeszczepów. Niedobór CD26 spowodował częściowo upośledzone różnicowanie subpopulacji Th1, Th2 i Th17, ale zwiększył odsetek Tregs. Z kolei zmniejszone funkcje Th1, Th2 i Th17 wpływały na różnicowanie komórek B i zmniejszały aktywność komórek CD8+ i makrofagów, co prowadziło do mniejszej produkcji IgG i opóźnionego odrzucania alloprzeszczepu u myszy CD26-/-.
.