Elucidating the functional role of Mycobacterium smegmatis recX in stress response

Hypoxia powoduje wzrost ekspresji genów M. smegmatis recA i recX

Podczas infekcji i proliferacji, M. tuberculosis jest narażona na fizjologiczne warunki stresowe, takie jak hipoksja i kwaśne pH, które mogą zagrozić jej przeżyciu38,39,40. Na przykład, ostry stres hipoksyjny zatrzymuje replikację DNA i wyzwala silne uszkodzenia DNA41,42,43. Wzrost ekspresji genów szlaku SOS, w tym umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB i uvrD, rozpoczyna się po uszkodzeniu DNA44,45,46. W tym celu profilowanie ekspresji genów indukowanej hipoksją u M. smegmatis i M. tuberculosis podczas zakażenia latentnego dostarczyło cennych spostrzeżeń na temat natury latentnych prątków gruźlicy i ich leczenia47.

Wcześniejsze badania u M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 i Streptomyces lividans50 wykazały, że recA ulega ko-transkrypcji z recX. Co więcej, nadekspresja RecA (pozytywnego regulatora odpowiedzi SOS) okazała się toksyczna przy braku RecX u niektórych gatunków bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 i Xanthomonas oryzae53. Odkrycia te są zgodne z koncepcją, że RecX działa jako antyrekombinaza, tłumiąc niewłaściwe zdarzenia rekombinacyjne promowane przez RecA14. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja RecA w szczepie E. coli ΔrecX nie jest szkodliwa, a delecja recX nie wpływa na ekspresję recA54. Transkrypcja recX w E. coli jest obniżona w porównaniu do recA w normalnych warunkach wzrostu z powodu istnienia miejsca terminacji transkrypcji pomiędzy sekwencjami kodującymi recA i recX. Jednakże, transkrypt mRNA recA-recX powstający w wyniku transkrypcyjnej read-through gromadzi się w zakresie 5-10% całkowitej zawartości mRNA recA54. Transkrypt recX był prawie niewykrywalny podczas wzrostu wegetatywnego E. coli, ale silna ekspresja recX występuje po traktowaniu czynnikami uszkadzającymi DNA15,55.

Genomy zarówno M. smegmatis jak i M. tuberculosis zawierają po jednej kopii recA i recX w pojedynczym operonie. W celu zbadania ekspresji i regulacji tych genów w warunkach tlenowego i hipoksyjnego wzrostu u M. smegmatis, powszechnie stosowanego modelu zastępczego dla M. tuberculosis, względna obfitość mRNA w różnych fazach wzrostu została zmierzona testem RT-qPCR i znormalizowana do konstytutywnie wyrażonego genu 16S rRNA. Wartości progu cyklu (Ct) dla mRNA M. smegmatis recA i recX zostały znormalizowane w stosunku do wartości Ct genu 16S rRNA. W przeciwieństwie do E. coli15,55, znaczącą ilość transkryptów mRNA recA zaobserwowano we wczesnej fazie log zarówno w warunkach hodowli tlenowej, jak i hipoksyjnej (Rys. 1A). Co ciekawe, warunki hipoksyjne zwiększyły akumulację recA mRNA 1,5-krotnie w połowie fazylog, a następnie zmniejszały ją w miarę wchodzenia komórek w fazę stacjonarną. Podobną prawidłowość zaobserwowano w przypadku mRNA recX zarówno w warunkach tlenowych, jak i hipoksyjnych, aczkolwiek na niższym poziomie (Rys. 1B). Obserwacje te potwierdzają tezę, że te dwa geny są współtranskrybowane i koordynacyjnie regulowane w warunkach tlenowych i hipoksyjnych. Co ciekawe, nie zaobserwowano różnicy w ilości mRNA we wczesnej fazie log we wzrostach w warunkach tlenowych i hipoksyjnych. Profile transkrypcyjne genów markerowych specyficznych dla fazy wzrostu M. smegmatis (sigH2 i sigH7)56 posłużyły do określenia czasu trwania fazy early-log, mid-log i fazy stacjonarnej (ryc. 1C). W wielolekoopornych szczepach klinicznych M. tuberculosis stwierdzono, że poziomy mRNA zarówno recA jak i recX są wyższe niż w szczepach lekoopornych, a poziomy mRNA recX wzrastały równolegle ze wzrostem mRNA recA57.

Należy jednak zauważyć, że poziomy mRNA nie mogą być stosowane jako surogaty dla odpowiadających im poziomów białka. Dlatego też, obfitość białek RecA i RecX w M. smegmatis była mierzona w warunkach tlenowych i hipoksyjnych za pomocą testu Western blot z użyciem przeciwciał anty-RecA i anty-RecX. GroEL był sondowany jako kontrola obciążenia białkowego. Analiza densytometryczna immunoblotów wykazała, że komórki gromadziły wyższe poziomy RecA w warunkach hipoksji w porównaniu do warunków tlenowych (Rys. 2A,B). Analiza porównawcza wykazała, że komórki konsekwentnie gromadziły 2-krotnie wyższe poziomy RecA w połowie fazy log w stosunku do wczesnej fazy log w warunkach wzrostu tlenowego, które zmniejszały się w fazie stacjonarnej do poziomów obserwowanych we wczesnej fazie log (Fig. 2A,B). Podobny wzorzec zaobserwowano dla RecX, aczkolwiek poziomy były mniej wyraźne niż w przypadku RecA (Rys. 2A,C). Chociaż wzory ekspresji mRNA i białka były porównywalne, zauważono istotne różnice. Po pierwsze, białko RecX było prawie niewykrywalne we wczesnej fazielogicznej w warunkach hipoksji. Po drugie, obfitość mRNA i białka RecA była wyższa w porównaniu do RecX.

Ale wyniki te sugerują, że geny M. smegmatis recA i recX są indukowane w warunkach hipoksji, nie ma korelacji pomiędzy ilością mRNA recX i odpowiadającego mu białka we wczesnej fazie log. Wykazano, że zarówno M. tuberculosis, jak i M. smegmatis stabilizują swoje transkrypty mRNA w warunkach hamujących wzrost58,59,60. Wśród możliwych mechanizmów wykazano, że przeprogramowanie tRNA i selektywna translacja kodonowa odgrywają rolę u prątków w odpowiedzi na hipoksję61. Jednym z możliwych wyjaśnień braku korelacji między poziomem mRNA recX a poziomem białka we wczesnej fazie log może być translacyjna represja mRNA recX.

Konstrukcja szczepów mutantów ΔrecX i ΔrecA ΔrecX

Różnice w poziomach białek RecA i RecX u M. smegmatis wskazują na możliwą regulację ekspresji genów na poziomie transkrypcji. U wielu bakterii badanych do tej pory, gen recX jest zlokalizowany na tej samej nici kodującej, poniżej recA i oba geny są współtranskrybowane48,50,53,54,62,63. Jednakże, w locus lexA-recA-recX patogenów Xanthomonas, każdy z genów ulega ekspresji z własnego promotora64. Ponadto, u D. radiodurans65,66, B. subtilis67 i N. gonorrhoeae26, geny recA i recX są oddzielone na długości kilkuset kb i transkrybowane z własnych promotorów.

W wielu gatunkach prątków, jak również u kilku innych bakterii, region 5′ sekwencji kodującej recX nakłada się na region 3′ genu recA. W M. smegmatis48 zachodzenie to ma długość 32 bp, natomiast w M. tuberculosis68 i M. leprae69 zachodzenie to wynosi 35 bp. Wpływ delecji recX na cechy fenotypowe był badany u różnych organizmów7,10. Mutanty nokautujące recX wykazują szereg fenotypów związanych z funkcjami RecA: inaktywacja recX u B. subtilis powodowała, że komórki były wrażliwe na MMS i H2O225, mutanty recX u S. lividans wykazywały zmniejszoną odporność na uszkodzenia UV42, a mutant recX u N. gonorrhoeae wykazywał niewielki spadek zdolności do przetrwania uszkodzeń DNA spowodowanych przerwaniem podwójnej nici26. Jednakże, wpływ delecji genów recA i recX na charakterystykę wzrostu i naprawę uszkodzeń DNA nie został zbadany w żadnym organizmie. Co więcej, pełne zrozumienie roli in vivo recX w prątkach nie jest w pełni zrozumiałe.

Wcześniejsze badania wykazały, że szczep M. smegmatis ΔrecA wykazywał wrażliwość na uszkodzenia DNA indukowane promieniowaniem UV i nie promuje HR52. Połączyliśmy mutację recA z delecją recX, aby zbadać efekty podwójnej mutacji. W tym celu wygenerowano szczepy M. smegmatis mc2155 recX pojedynczy i recArecX podwójnie zmutowany. Jako kontrolę, dla bezpośredniego porównania, ponownie oceniono efekt delecji recA u M. smegmatis. Stosując metodę rekombinacji, która jest oparta na protokole opracowanym dla M. tuberculosis i M. bovis BCG28, wygenerowano mutanty M. smegmatis mc2155 ΔrecA i ΔrecAΔrecX, używając odpowiednio 3,279 kb i 3,302 kb liniowych konstruktów ΔrecA::hyg i ΔrecAΔrecX::hyg AES. W wyniku trawienia restrykcyjnego odpowiednich plazmidów za pomocą EcoRV otrzymano około 100 ng liniowych fragmentów DNA AES (Rys. 3A). Fragmenty te transformowano do kompetentnych komórek rekombinujących M. smegmatis mc2155:pJV5370. Po 4-5 dniach inkubacji stwierdzono 8-10 kolonii opornych na Hyg dla mutantów ΔrecX i ΔrecAΔrecX. Przypuszczalne zmutowane szczepy zostały przesiane za pomocą PCR, aby określić, czy geny recX i recArecX zostały usunięte z chromosomu (dane nie pokazane). Prawidłowe mutanty hodowano w podłożu agarowym 7H10 Middlebrook przez 5-8 pokoleń, aby umożliwić utratę pJV53.

Analiza genotypowa i fenotypowa M. smegmatis ΔrecX i mutantów ΔrecAΔrecX

Po przesiewie metodą PCR uzyskano po 2 mutanty nokautujące ΔrecX i ΔrecAΔrecX szczepu M. smegmatis mc2155. Mutanty ΔrecX i ΔrecAΔrecX scharakteryzowano za pomocą mapowania enzymami restrykcyjnymi i hybrydyzacji Southern blot (ryc. 3). Po hybrydyzacji z odpowiednimi sondami znakowanymi radioaktywnie, w przypadku komórek M. smegmatis mc2155 typu dzikiego zaobserwowano fragment o wielkości 4,1 kb. W mutantach ΔrecX i ΔrecAΔrecX zaobserwowano fragmenty o przewidywanej wielkości 3,14 kb i 2,09 kb (ryc. 3B,C). Oba te pasma są mniejsze niż 4,1 kb, co wskazuje, że geny recX i recArecX zostały usunięte w wyniku wymiany allelicznej. Częstość wymiany allelicznej w odniesieniu do recX i recArecX mieściła się odpowiednio w zakresie 70% i 80%.

Jednym zastrzeżeniem tej analizy jest to, że obserwowane efekty mutacji ΔrecX i ΔrecAΔrecX mogą wynikać z polarnych efektów insercji genu oporności na higromycynę. Ogólnie rzecz biorąc, zmiany genetyczne wokół locus recA-recX mogą prowadzić do biegunowego wpływu na ekspresję genów znajdujących się poniżej locus recA-recX. Przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty w celu zbadania potencjalnych efektów polarnych. Po pierwsze, mutanty ΔrecX i ΔrecAΔrecX uzupełniono funkcjonalnymi kopiami genów recA i recX. Transformanty oceniano pod względem ich zdolności do wzrostu w standardowym podłożu hodowlanym i ochrony zmutowanych komórek przed promieniowaniem UV. Dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia nanoszono na płytki agarowe 7H10 i analizowano. Jak pokazano na Rys. 4A,B, dziki typ recA częściowo uzupełniał szczepy mutantów ΔrecA i ΔrecAΔrecX, co wynikało z ich zdolności do wspomagania wzrostu i zapewnienia ochrony przed promieniowaniem UV. Jednakże, dziki typ recX nie ratował fenotypu szczepów zmutowanych ΔrecAΔrecX obserwowanego po indukcji uszkodzeń DNA przez promieniowanie UV. Ponieważ delecja recX nie miała zauważalnego wpływu na wzrost w warunkach normalnych i w warunkach uszkodzenia DNA, ΔrecX i odpowiadający mu szczep komplementarny wykazywały podobny wzrost jak szczepy typu dzikiego.

Po drugie, oceniliśmy ekspresję dwóch genów M. smegmatis mc2155, gluD (MSMEG_2725) i glnH (MSMEG_2726), zlokalizowanych poniżej locus recA recX w szczepach zmutowanych ΔrecA ΔrecX i ΔrecX w porównaniu ze szczepem typu dzikiego. Jako kontrolę pozytywną zastosowano gen M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) zlokalizowany upstream locus recA-recX. Całkowite RNA przygotowano ze szczepów typu dzikiego, mutantów ΔrecA ΔrecX i ΔrecX. Względne obfitości transkryptów genów określono metodą ilościowego RT-qPCR i znormalizowano do konstytutywnie wyrażonego chromosomalnego genu 16S rRNA. Poziomy ekspresji zostały zmierzone z komórek wyrosłych w późnej fazie wzrostu wykładniczego. We wszystkich przypadkach profile ekspresji genów ORF zarówno upstream jak i downstream były podobne dla szczepów typu dzikiego i zmutowanych (Rys. 4C). Łącznie, wyniki te wykluczają możliwość, że insercja genu oporności na higromycynę powoduje efekty biegunowe.

Szczepy mutantów M. smegmatis ΔrecA i ΔrecA ΔrecX wykazują upośledzony wzrost i zmniejszoną wydajność komórek w stosunku do szczepu typu dzikiego

Aby scharakteryzować szczepy M. smegmatis ΔrecX i ΔrecA ΔrecX, profile wzrostu szczepów typu dzikiego i szczepów pozbawionych mutacji były mierzone w bulionie 7H9 Middlebrook w temperaturze 37 °C (ryc. 5). Delecja recX nie miała zauważalnego wpływu (w porównaniu do szczepu typu dzikiego) na wzrost M. smegmatis. W podobnych warunkach, delecja recA wyraźnie zwiększyła długość fazy lag i jednocześnie zmniejszyła fazę wzrostu wykładniczego, co sugeruje, że recA odgrywa rolę we wzroście i żywotności M. smegmatis. Ponadto, wyniki te są zgodne ze znaną funkcją RecA w ratowaniu zatrzymanych lub zawalonych widełek replikacyjnych71,72,73. Ponieważ geny recA i recX tworzą pojedynczy operon, zbadano wpływ ich delecji na wzrost M. smegmatis. Szczep z delecją ΔrecA ΔrecX wykazywał fenotyp wzrostu, który był pośredni między mutantem ΔrecA a szczepem typu dzikiego; jednak wzrost w późnych fazach log i stacjonarnej był podobny do wzrostu szczepów ΔrecA i typu dzikiego.

Delecja recA, ale nie recX, czyni M. smegmatis bardziej podatnym na czynniki uszkadzające DNA

Podobnie jak u innych eubakterii, prątkowe białko RecA odgrywa kluczową rolę w regulacji odpowiedzi SOS po uszkodzeniu DNA74,75,76,77. Aby sprawdzić, czy brak recArecX i recX wpływa na zdolność M. smegmatis do efektywnej naprawy uszkodzonego DNA, mutanty wystawiono na działanie czynników o różnych mechanizmach uszkodzenia DNA. W doświadczeniach tych stres indukowano poprzez ekspozycję szczepów zmutowanych ΔrecA, ΔrecX i ΔrecA ΔrecX na promieniowanie UV, MMS, H2O2 lub ciprofloksacynę podczas fazy wykładniczej (OD600 0,6) wzrostu bakterii. Po 3 h inkubacji komórki przemywano, a ich żywotność oceniano poprzez naniesienie dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń hodowli na płytki agarowe Middlebrooka 7H10 zawierające higromycynę (100 µg/ml). Najbardziej odpowiednie stężenie/dawkę czynników uszkadzających DNA określono po ocenie różnic w żywotności komórek między szczepami przy użyciu testów płytkowych. W przypadku braku czynników uszkadzających DNA, wszystkie szczepy wykazywały podobny poziom żywotności komórek (Rys. 6). Natomiast w obecności czynników uszkadzających DNA, szczep ΔrecA wykazywał wyraźny defekt wzrostu, któremu towarzyszył 100-krotny spadek wydajności płytek w stosunku do szczepu typu dzikiego. Fenotyp ten jest zgodny z dostępną literaturą. Z kolei śmiertelny efekt UV, MMS lub ciprofloksacyny, ale nie H2O2, był częściowo blokowany przez delecję genu recX w szczepie ΔrecA. Chociaż podstawa braku efektu H2O2 nie jest jasna, prawdopodobnie zastosowane stężenie nie było wystarczająco wysokie, aby wpłynąć na wzrost. Co ciekawe, szczep ΔrecX wykazywał nieco bardziej oporny fenotyp wobec wszystkich czterech czynników uszkadzających DNA niż szczep ΔrecA ΔrecX, co wskazuje na możliwy zysk funkcji spowodowany utratą genu recX. Biorąc pod uwagę te wyniki, jest oczywiste, że recA odgrywa aktywną rolę w odpowiedzi SOS i że wrażliwość na czynniki uszkadzające DNA jest nieznacznie stłumiona w szczepie ΔrecX.

Wyżycie po traktowaniu różnymi stężeniami czynników uszkadzających DNA

Mikobakterie doświadczają wielu niekorzystnych warunków stresowych, takich jak stres oksydacyjny, żywieniowy i wywołany lekami78,79,80,81,82. Aby dokładniej zbadać różnice w żywotności komórek, przeprowadzono eksperymenty, w których żywotność komórek mierzono za pomocą jednostek tworzących kolonie (CFU). Po pierwsze, żywotność mutantów M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX i ΔrecAΔrecX badano w porównaniu z mutantami typu dzikiego, poddając je działaniu wzrastających stężeń MMS. Szczepy hodowano w obecności wskazanych stężeń MMS, aż do osiągnięcia przez hodowle OD600 równej 0,6. Żywotność komórek oceniano poprzez posiew określonej liczby komórek na płytki agarowe 7H10. Komórki uznawano za żywe, jeśli były w stanie dzielić się i tworzyć kolonie. Mutanty, w przeciwieństwie do szczepu typu dzikiego, wykazywały zwiększoną wrażliwość na MMS w sposób zależny od stężenia. Analiza ilościowa wykazała, że mutant ΔrecA wykazywał stosunkowo wyższą wrażliwość na MMS, która wzrastała wraz ze wzrostem stężenia MMS (Rys. 7A). W przypadku ΔrecX, komórki były ~2-krotnie mniej wrażliwe na MMS w porównaniu do komórek ΔrecA. Z drugiej strony, mutant ΔrecA ΔrecX wykazywał większą wrażliwość na MMS w przeciwieństwie do mutanta ΔrecX. Wrażliwość mutanta ΔrecX na MMS wskazuje, że recX może mieć jeszcze niezidentyfikowane cele oprócz RecA. To przypuszczenie wymaga dalszych badań.

Następnie, czułości M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX i szczepów zmutowanych ΔrecA ΔrecX w stosunku do szczepu typu dzikiego określono poprzez poddanie ich działaniu wzrastających stężeń H2O2. Wyniki wskazują, że mutant ΔrecA był mniej wrażliwy na to traktowanie (Rys. 7B). Delecja samego recX lub delecja locus recA-recX miała jedynie niewielki wpływ na żywotność i proliferację zmutowanych komórek w odpowiedzi na traktowanie H2O2. Warto zauważyć, że szczepy mutantów ΔrecA i ΔrecAΔrecX wykazywały wrażliwy fenotyp wzrostu na promieniowanie UV i ciprofloksacynę, który jest znacznie bardziej dotkliwy niż na MMS lub H2O2 (Fig. 7C,D). Ponadto, szczep ΔrecA wykazywał większą wrażliwość na promieniowanie UV i ciprofloksacynę niż szczep podwójnie zmutowany ΔrecA ΔrecX.

Ekspresja genów recA i recX jest indukowana przez uszkodzenia DNA

Elementy regulatorowe upstream genu recA nie są konserwowane u wszystkich gatunków prątków. Na przykład, gen recA M. tuberculosis jest transkrybowany z dwóch promotorów: oba są indukowane przez uszkodzenia DNA, aczkolwiek poprzez różne mechanizmy. Promotor P1 genu M. tuberculosis recA (proksymalnie do kodonu start) może być indukowany po uszkodzeniu DNA niezależnie od białek LexA i RecA. Natomiast promotor P2 (zlokalizowany z dala od kodonu startu recA) jest regulowany przez LexA, który jest funkcjonalnie analogiczny do promotora recA E. coli83,84,85. Co ciekawe, mechanizm indukcji uszkodzeń DNA u M. tuberculosis nie jest w pełni zachowany u M. smegmatis46,75. Odkrycia te podkreślają potrzebę zrozumienia ekspresji i regulacji genów M. smegmatis recA i recX oraz ich roli w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA.

Jak opisano powyżej, hipoksja spowodowała wzrost ekspresji genów M. smegmatis recA i recX (ryc. 1). Aby dodatkowo potwierdzić tezę, że ekspresja genów M. smegmatis recA i recX jest indukowana uszkodzeniami, określono kinetykę indukcji z i bez uszkodzeń DNA przy użyciu RT-qPCR. Próbki całkowitego RNA przygotowano z komórek M. smegmatis zebranych w 0, 3, 6, 9 i 12 h po ekspozycji na promieniowanie UV, jak również z hodowli nieleczonych i analizowano zgodnie z opisem w rozdziale Metody. Wyniki nie wykazały istotnych różnic pomiędzy poziomami transkryptów recA i recX w komórkach nieleczonych. Natomiast wyraźny wzrost transkryptów mRNA recA i recX zaobserwowano 3 h po ekspozycji na promieniowanie UV, a następnie ich nieznaczny spadek. Porównanie danych RT-qPCR wskazuje na istotne różnice pomiędzy poziomami transkryptów recA i recX. Ekspozycja na promieniowanie UV spowodowała ~8-krotny wzrost mRNA recA w stosunku do kontroli, podczas gdy recX ~3-krotny (Rys. 8A,B). Tak więc, chociaż recA i recX mRNA istnieją w tej samej jednostce transkrypcyjnej, wyniki te wspierają ideę, że produkcja i/lub stabilność transkryptu recX mRNA podlega dodatkowemu posttranskrypcyjnemu mechanizmowi regulacyjnemu.

Wyniki te skłoniły nas do przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów w celu określenia kinetyki akumulacji białek RecA i RecX w komórkach M. smegmatis z lub bez uszkodzeń DNA. Wykonano testy Western blot na całych lizatach komórkowych z użyciem przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko RecA i RecX (Rys. 8C). Kwantyfikacja Western blot wykazała, że komórki zawierały znaczne ilości białek RecA i RecX w komórkach nieindukowanych (Rys. 8D,E). Dla porównania, w komórkach 3 h po ekspozycji na promieniowanie UV zaobserwowano 2-krotny wzrost obfitości zarówno RecA, jak i RecX (w stosunku do kontroli), a następnie jej spadek. Co ważne, indukcja białek RecA i RecX wykazywała wzór przypominający ten obserwowany w komórkach w warunkach hipoksji (Rys. 2), chociaż mechanizmy, dzięki którym uszkadzają one DNA, są prawdopodobnie inne.

Uwagi końcowe

Liczba badań wykazała, że recA i recX pełnią szeroki zakres funkcji związanych z naprawą DNA i rekombinacją7,10. Według naszej wiedzy nie zidentyfikowano bodźców, które aktywują ekspresję genów recA i recX u M. smegmatis. W niniejszej pracy oceniano poziom ekspresji tych genów w komórkach w warunkach wzrostu tlenowego oraz w odpowiedzi na różne warunki stresowe. U M. smegmatis, podobnie jak u wielu gatunków bakterii, recA i recX należą do tego samego operonu, a gen recX jest zlokalizowany bezpośrednio za genem recA i posiada nakładające się regiony kodujące86. Stwierdzono, że czynniki uszkadzające DNA indukują ekspresję obu genów w różnym stopniu, jednak proporcje ekspresji przebiegają według podobnego schematu. Co ciekawe, poziomy zarówno RecA, jak i RecX pozostają wysokie w warunkach stresu w porównaniu z warunkami wzrostu tlenowego.

Wiele badań wykazało alternatywne role recX w rekombinacyjnej naprawie DNA promowanej przez RecA. Podczas gdy białko RecX fizycznie oddziałuje z RecA i funkcjonuje jako silny inhibitor wszystkich znanych funkcji tego ostatniego u wielu gatunków bakterii14,46,48, potęguje ono rekombinację homologiczną u N. gonorrhoeae i B. subtilis25,26. Aby uzyskać wgląd w rolę recX w odpowiedzi na stres u prątków, skonstruowano mutanty nokautujące M. smegmatis recX i recArecX. Co ciekawe, delecja recX u M. smegmatis skutkowała nieznacznie bardziej opornym fenotypem wobec wszystkich czterech czynników uszkadzających DNA, wskazując na możliwy zysk funkcji spowodowany utratą genu recX. Molekularna podstawa tego efektu nie jest jasna, co wydaje się warte zbadania w przyszłych badaniach. Podczas gdy nasza analiza skupiała się głównie na genetycznej interakcji pomiędzy recA i recX w szlaku rekombinacyjnej naprawy DNA, co ciekawe, recX wydaje się odgrywać ważną rolę we wzroście bakterii. Podsumowując, wyniki te są zgodne z koncepcją, że M. smegmatis recX odgrywa ważną rolę w procesach naprawy/rekombinacji DNA w niekorzystnych warunkach, być może poprzez regulację szkodliwych efektów podzbioru nieznanych jeszcze genów.

Użyte skróty to

DTT, dithiothreitol; EDTA, kwas etylenodiaminotetraoctowy; kb, kilobaza; MMS, metylometanosulfonian; ODN, oligonukleotyd; PAGE, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; PVDF, membrana z polifluorku winylidenu; RT-qPCR, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją; SDS, dodecylosiarczan sodu; ssDNA, jednoniciowy DNA; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M bufor cytrynianu sodu (pH 7,0).