Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy

Signaling through the intrinsic pathway of apoptosis

W mitochondrial pathway of apoptosis, aktywacja kaspaz jest ściśle związana z permeabilizacją zewnętrznej błony mitochondrialnej przez proapoptotycznych członków rodziny Bcl (Green i Kroemer, 2004). Liczne bodźce cytotoksyczne i proapoptotyczne cząsteczki przenoszące sygnały oddziałują na mitochondria, indukując permeabilizację zewnętrznej błony mitochondrialnej (Decaudin i in., 1998; Green i Kroemer, 2004). Permeabilizacja ta jest regulowana przez białka z rodziny Bcl-2, lipidy mitochondrialne, białka regulujące przepływ metabolitów bioenergetycznych oraz składniki porów przepuszczalności (Green i Kroemer, 2004). Po przerwaniu zewnętrznej błony mitochondrialnej uwalniany jest zestaw białek, które normalnie znajdują się w przestrzeni pomiędzy wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondrialną, w tym cytochrom c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF i endonukleaza G (Saelens i in., 2004). Po dostaniu się do cytozolu, te apoptogenne białka wywołują śmierć komórki poprzez promowanie aktywacji kaspaz lub poprzez działanie jako niezależne od kaspaz efektory śmierci (Saelens i in., 2004).

Mitochondrialne mediatory apoptozy zależnej od kaspaz

Cytochrom c

Uwolnienie cytochromu c z mitochondriów bezpośrednio wyzwala aktywację kaspazy-3 poprzez utworzenie kompleksu apoptosomu zawierającego cytochrom c/Apaf-1/kaspazę-9 (Cain i in., 2000). Po dostaniu się do cytozolu cytochrom c wiąże się z C-końcowym regionem Apaf-1, cytozolowego białka z N-końcową domeną rekrutacji kaspaz (CARD), domeną wiążącą nukleotydy o homologii do Caenorhabditis elegans CED-4 i C-końcową domeną zawierającą 12-13 powtórzeń WD-40 (Zou i in., 1997). Związanie cytochromu c z Apaf-1 ułatwia asocjację dATP z Apaf-1 i odsłania jego N-końcową CARD, która może teraz oligomeryzować i stać się platformą, na której inicjująca kaspaza-9 jest rekrutowana i aktywowana poprzez interakcję CARD-CARD (Adrain i in., 1999). Następnie, kaspaza-3 jest rekrutowana do apoptosomu, gdzie jest aktywowana przez kaspazę-9 (Bratton i in., 2001). Kaspaza-3 następnie rozszczepia kluczowe substraty w komórce w celu wytworzenia wielu komórkowych i biochemicznych zdarzeń apoptozy.

W niektórych przypadkach, aktywność kaspazy zainicjowana przez cytozolowy cytochrom c przyczynia się do spadku metaloproteinazy macierzy (MMP), jak wykazano przy użyciu syntetycznych inhibitorów kaspazy i komórek Apaf1 -/- (Waterhouse i in., 2001). Ponadto, aktywność kaspaz dodatkowo uszkadza funkcje permeabilizowanych mitochondriów poprzez wpływ na aktywność kompleksów I i II, co nieuchronnie prowadzi do utraty MMP i generowania reaktywnych form tlenu (Ricci i in., 2004). Tak więc, wtórne zdarzenia wynikające ze zmian cytozolowych, spowodowane uwolnieniem cytochromu c i innych mitochondrialnych białek IMS, mogą wracać do permeabilizowanych mitochondriów i wpływać na ich funkcję. Co ważne, ta mitochondrialna pętla wzmacniająca aktywność kaspaz może krytycznie determinować odpowiedź komórek nowotworowych na leczenie cytotoksyczne.

Co więcej, istnieją ostatnie dowody na istnienie niezależnego od cytochromu c i apoptosomu, ale zależnego od Apaf-1 mechanizmu(ów) aktywacji kaspaz. Ukierunkowany knock-in wariantu cytochromu c, który nie ma właściwości apoptogennych, ale ma transfer elektronów i aktywność antyoksydacyjną (K72A), pozwolił na ocenę udziału cytochromu c w apoptozie bez wpływu na jego funkcję w fosforylacji oksydacyjnej (Hao i in., 2005). Co ciekawe, tymocyty pochodzące od myszy KA/KA były znacznie bardziej wrażliwe na bodźce śmierci, w tym etopozyd i promieniowanie γ, niż tymocyty Apaf-1(-/-) (Hao i in., 2005). Po traktowaniu promieniowaniem γ, prokaspazy były wydajnie aktywowane w apoptotycznych tymocytach KA/KA, ale oligomeryzacja Apaf-1 nie była obserwowana (Hao i in., 2005), wskazując na odmienne wymagania dla cytochromu c i Apaf-1 w apoptozie.

Smac/DIABLO

Inne białka uwalniane z mitochondriów, takie jak Smac/DIABLO i Omi/HtrA2, ułatwiają aktywację kaspaz poprzez neutralizację endogennych inhibitorów kaspaz, białek hamujących apoptozę (IAPs). Smac i jego muruński homolog DIABLO są mitochondrialnymi białkami kodowanymi jądrowo, zawierającymi sygnał lokalizacji mitochondrialnej, który jest proteolitycznie usuwany podczas importu mitochondrialnego w celu uzyskania dojrzałego białka o masie 23 kDa (Du i in., 2000; Verhagen i in., 2000). Ten etap dojrzewania odsłania motyw wi±ż±cy IAP (IBM) na N-końcu Smac/DIABLO (Du i in., 2000) (Tabela 1). Wykazano, że drugi mitochondrialny aktywator kaspazy/DIABLO wi±że się z XIAP, cIAP1, cIAP2, survivinem i Apollonem w sposób zależny od BIR (Vaux i Silke, 2003) (Ryc. 2), działaj±c jako homodimer z IBM obecnym w konfiguracji dwuwarto¶ciowej (Chai i in., 2000). Jeden dimer Smac/DIABLO wiąże jedną cząsteczkę XIAP przez oba motywy wiążące IAP, z których jeden oddziałuje z BIR2, a drugi z BIR3 (Huang i in., 2003). Co intrygujące, ten sam rowek BIR3 wiąże IBM odsłonięty na N-końcu (Ala-Thr-Pro-Phe) małej podjednostki kaspazy-9 po jej autokatalitycznym przetworzeniu po Asp315, umożliwiając Smac/DIABLO wypieranie kaspazy-9 z XIAP (Srinivasula i in., 2001) (Tabela 1).

Fizjologiczna mitochondrialna funkcja Smac/DIABLO jest nieznana, a myszy DIABLO -/- wydają się normalne (Okada i in., 2002). Chociaż rozszczepienie prokaspazy-3 in vitro po dodaniu cytochromu c było zahamowane w lizatach komórek Smac -/-, myszy i komórki Smac -/- reagowały normalnie na bodźce apoptotyczne, takie jak promieniowanie UV, staurosporyna, etopozyd i TNF/cykloheksamid (Okada i in., 2002). Obserwacje te sugerują istnienie redundantnych czynników kompensujących utratę Smac/DIABLO, prawdopodobnie HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 jest kodowanym jądrowo białkiem o masie 49 kDa z N-końcowym sygnałem lokalizacji mitochondrialnej, który pośredniczy w jego translokacji do mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej (Suzuki i in., 2001; Martins i in., 2002; van Loo i in., 2002). Omi/HtrA2 jest przetwarzana w przestrzeni międzybłonowej do postaci dojrzałej o masie 37 kDa, uwalniając IBM na jej N-końcu (Suzuki i in., 2001; Martins i in., 2002; van Loo i in., 2002) (Tabela 1). Chociaż rekombinowany Omi/HtrA2 może katalizować własne dojrzewanie in vitro, proteaza odpowiedzialna za jego dojrzewanie w komórkach pozostaje nieznana (Martins i in., 2002). Omi/HtrA2 odgrywa istotną rolę w regulacji homeostazy mitochondrialnej wymagającej jej aktywności proteolitycznej, chociaż cele molekularne i partnerzy interakcji Omi/HtrA2 w mitochondrium nie zostały jeszcze określone (Saelens i in., 2004). Po uwolnieniu Omi/HtrA2 z mitochondriów do cytozolu, promuje on śmierć komórki w sposób zależny od kaspaz poprzez antagonizowanie IAPs oraz w sposób niezależny od kaspaz jako proteaza (Saelens i in., 2004). Podobnie jak Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 blokuje IAP poprzez swój N-końcowy motyw wiążący IAP, występujący w konfiguracji trimerycznej (Li i in., 2002)

Pomimo, że uwolnienie cytochromu c do cytozolu bezpośrednio wyzwala aktywację kaspazy-3 poprzez utworzenie kompleksu apoptosomowego zawierającego cytochrom c/Apaf-1/kaspazę-9, Smac/DIABLO i Omi/HtrA2 pośrednio promują aktywację kaspaz poprzez antagonizowanie hamującego wpływu do IAPs (Saelens i in., 2004). W ten sposób istnieje dynamiczna równowaga pomiędzy pro- i antyapoptotycznymi cząsteczkami efektorowymi, co pozwala komórce radzić sobie z ograniczonym uszkodzeniem mitochondriów, w którym to przypadku IAP mogą odpowiednio blokować aktywację kaspaz zainicjowaną przez niewielką ilość uwolnionego cytochromu c. Jednakże w okolicznościach, w których uszkodzenie mitochondrialne postępuje lub dotyczy jednocześnie wielu mitochondriów, przeszkoda antyapoptotyczna narzucona przez IAP może zostać pokonana przez wyższe cytozolowe stężenie ich antagonistów Smac/DIABLO i HtrA2/OMI, które neutralizują IAP przez bezpośrednie wiązanie.

Istnieją coraz liczniejsze dowody na to, że komórki nowotworowe mają samoistne dążenie do apoptozy, które jest utrzymywane w ryzach przez IAP. W tym celu wykryto wysokie podstawowe poziomy aktywności kaspazy-3 i kaspazy-8 oraz aktywne fragmenty kaspazy-3 przy braku apoptozy w różnych liniach komórek nowotworowych i tkankach nowotworowych, ale nie w normalnych komórkach (Yang et al., 2003a). Komórki nowotworowe, ale nie komórki prawidłowe, również wykazywały wysoki poziom IAP, co sugeruje, że zwiększona ekspresja IAP przeciwdziała wysokiej podstawowej aktywności kaspaz selektywnie w komórkach nowotworowych (Yang i in., 2003a). Dlatego też strategie ukierunkowane na IAP są uważane za obiecujące podejście do selektywnego zwiększania skuteczności terapii cytotoksycznych w komórkach nowotworowych. W tym celu, wymuszona transfekcją ekspresja Smac/DIABLO obniżyła próg dla zabijania indukowanego TRAIL w różnych guzach (Ng i Bonavida, 2002; Okano i in., 2003), a także uwrażliwiła komórki nowotworowe na chemioterapię (McNeish i in., 2003; Zhao i in., 2006). Jednakże, translokacja endogennego Smac/DIABLO do cytozolu podczas apoptozy indukowanej lekami przeciwnowotworowymi nie wydaje się odgrywać istotnej roli w pewnych warunkach, na przykład w komórkach ludzkiego raka płuc po leczeniu etopozydem (Bartling i in., 2004). Redukcja Smac/DIABLO przez małe interferujące RNA (siRNA) nie miała wpływu na zabijanie przez etopozyd w tych komórkach, chociaż peptyd Smac-N7 wiążący IAP zwiększał apoptozę indukowaną etopozydem (Bartling et al., 2004). Dane te sugerują, że niedobór Smac/DIABLO może być kompensowany przez działanie redundantnych determinantów w niektórych komórkach nowotworowych.

Mitochondrialne mediatory apoptozy niezależnej od kaspaz

Po uwolnieniu z mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, HtrA2/OMI przyczynia się do śmierci komórki również w sposób niezależny od kaspaz jako proteaza oprócz promowania apoptozy w sposób zależny od kaspaz poprzez antagonizowanie IAPs (Suzuki i in., 2001; Martins i in., 2002; van Loo i in., 2002). Dane in vitro wykazały degradację XIAP, cIAP1, cIAP2 i Apollon przez aktywność proteazową HtrA2/OMI (Suzuki i in., 2004). Ponadto, Trencia i wsp. (2004) wykazali interakcję antyapoptotycznego PED/PEA-15 z cytozolowym HtrA2/OMI oraz jego degradację. Obniżenie poziomu HtrA2/OMI w komórkach przez antysens lub interferencję RNA obniża wrażliwość różnych nowotworowych linii komórkowych na śmierć komórki indukowaną przez staurosporynę, Fas, UV lub cisplatynę (Martins i in., 2002).

Więcej, AIF i endonukleaza G są uwalniane z mitochondriów po permeabilizacji zewnętrznej błony mitochondrialnej i przenoszą się do jądra, aby przyczynić się do kondensacji chromatyny jądrowej i fragmentacji DNA na dużą skalę (Cande i in., 2004; Saelens i in., 2004). To, czy te dwa białka są uwalniane przed, razem czy po cytochromie c, było przedmiotem kontrowersji (Arnoult i in., 2002). Nadal nie jest też dokładnie jasne, w jaki sposób AIF przyczynia się do fragmentacji jądrowego DNA, ponieważ nie posiada wewnętrznej aktywności DNazy. W komórkach ssaków cyklofilina A, peptydylo-prolylowa izomeraza cis-trans, współpracuje z AIF w indukowaniu rozpadu DNA (Cande i in., 2004).

Zaburzenia szlaku wewnątrzpochodnego w nowotworach

Mutacje w genach zaangażowanych w regulację szlaku mitochondrialnego są bardzo powszechne w komórkach nowotworowych. Ponieważ większość terapii przeciwnowotworowych indukuje apoptozę w komórkach nowotworowych poprzez uruchomienie szlaku wewnętrznego, takie mutacje są zwykle związane z opornością na leczenie. Na przykład nadekspresja Bcl-2, będąca wynikiem chromosomalnej translokacji onkogenu bcl-2 do locus genu łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, jest związana z około 85% przypadków ludzkiego chłoniaka pęcherzykowego (Tsujimoto i in., 1984). Eksperymenty z transgenicznymi myszami wykazały, że nadekspresja Bcl-2 może promować transformację nowotworową limfocytów B i T oraz komórek mieloidalnych (McDonnell i Korsmeyer, 1991; Traver i in., 1998).

Zważywszy na fakt, że nadekspresja antyapoptotycznych członków rodziny Bcl-2 promuje onkogenezę, wynika z tego, że proapoptotyczni członkowie tej rodziny z wieloma domenami BH działają jako supresory nowotworów. Jednakże, ponieważ Bax i Bak mają w dużym stopniu pokrywające się role w apoptozie, trudno było ustalić, czy ta hipoteza jest prawdziwa i rzeczywiście myszy bax-/- nie są wyraźnie predysponowane do nowotworzenia (Knudson et al., 2001). Jednakże, mutacje somatyczne, które inaktywują gen bax zostały znalezione w niektórych guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu opisano mutacje polegające na substytucji pojedynczego nukleotydu lub mutacje typu frameshift, które inaktywują gen Bax w raku jelita grubego z niedoborem naprawy niedopasowania (MMR) lub w nowotworach hematopoetycznych (Rampino i in., 1997; Kitada i in., 2002).

Co więcej, istnieje coraz więcej dowodów na to, że białka BH3-only mogą przyczyniać się do hamowania transformacji złośliwej, wskazując, że mogą one funkcjonować jako bona fide supresory nowotworów. Na przykład wykazano, że utrata pojedynczego allelu Bim przyspiesza limfomagenezę komórek B indukowaną ekspresją transgenu c-myc (Egle i in., 2004), zgodnie z kluczową rolą Bim jako regulatora homeostazy limfoidalnej (Strasser, 2005). Co ciekawe, homozygotyczne delecje w regionie chromosomalnym, w którym znajduje się gen bim, zostały ostatnio zidentyfikowane u pacjentów z chłoniakiem z komórek płaszcza (Tagawa i in., 2005). U myszy pozbawionych genu bid spontanicznie rozwijają się zaburzenia mieloproliferacyjne, które mogą przejść w postać złośliwą przypominającą przewlekłą białaczkę mielomonocytową (CMML) (Zinkel i in., 2003). Co więcej, za pomocą RNAi stwierdzono, że supresja Puma przyspiesza limfomagenezę indukowaną przez Myc (Hemann i in., 2004).

Oprócz zmian genetycznych, nieprawidłowa ekspresja białek rodziny Bcl-2 jest regulowana głównie na poziomie transkrypcyjnym lub posttranskrypcyjnym. Na przykład, ekspresja kilku antyapoptotycznych białek rodziny Bcl-2, na przykład Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 lub Bfl-1, jest regulowana transkrypcyjnie przez NF-κB (Cory i Adams, 2002).

Oprócz białek rodziny Bcl-2, obniżoną aktywność Apaf-1 lub jej brak stwierdzono w raku jajnika, czerniaku i białaczce. Ponadto mutacje w genie supresorowym p53, najczęstszy defekt genetyczny w ludzkich nowotworach, wpływają na szlak intrinsic. Na przykład, aktywacja p53 powoduje wzrost regulacji szeregu genów posiadających w swoich promotorach elementy odpowiadające p53, takich jak proapoptotyczne białka BH3-only Puma, Noxa i Bid (Oda i in., 2000; Yu i in., 2001; Sax i in., 2002). W rezultacie komórki, w których p53 jest ustabilizowane, są uwrażliwione na aktywację mitochondrialnego szlaku śmierci komórkowej. Ponadto, p53 może bezpośrednio wpływać na integralność mitochondriów bez potrzeby aktywacji genów. Rzeczywiście, stwierdzono, że p53 może wiązać się z Bcl-2 i Bcl-XL w mitochondriach, promując w ten sposób destabilizację mitochondriów (Mihara i in., 2003).

Sygnalizacja poprzez szlak wewnątrzpochodny w terapii nowotworów

Większość konwencjonalnych środków chemioterapeutycznych, na przykład etopozyd, doksorubicyna, cisplatyna lub paklitaksel, wywołuje permeabilizację mitochondriów w sposób pośredni poprzez wywoływanie zaburzeń metabolizmu pośredniego lub poprzez zwiększanie stężenia proapoptotycznych drugich posłańców, na przykład przez indukowanie ekspresji p53, indukowanie szlaku ceramid/GD3, indukowanie systemu ligandów CD95/CD95L, wpływ na białka Bcl-2-podobne i (lub) przez naruszenie równowagi redoks lub równowagi energetycznej.

Istnieje coraz więcej dowodów na istnienie nukleo-mitochondrialnego cross-talk po uszkodzeniu DNA. Na przykład, sygnały apoptotyczne wynikające z uszkodzenia DNA mogą być przekazywane przez supresor nowotworu p53 do mitochondriów, które z kolei uwalniają do cytoplazmy czynniki apoptogenne, aktywujące programy destrukcji downstream (Moll i in., 2005). p53 może pośrednio angażować szlak mitochondrialny poprzez transkrypcyjną aktywację ekspresji proapoptotycznych białek Bcl-2, na przykład Bid, Puma lub Noxa (Oda i in., 2000; Yu i in., 2001; Sax i in., 2002). Dodatkowo, p53 może bezpośrednio wywoływać permeabilizację zewnętrznej błony mitochondrialnej w sposób niezależny od transkrypcji poprzez bezpośrednią aktywację proapoptotycznych białek Bcl-2, takich jak Bax lub Bak, lub poprzez wiązanie i inaktywację antyapoptotycznych białek Bcl-2, takich jak Bcl-2 lub Bcl-XL (Mihara i in., 2003; Chipuk i in., 2004; Moll i in., 2005). Co ważne, ostatnio wykazano, że mitochondrialnie ukierunkowane p53 posiada aktywność supresorową również in vivo (Talos i in., 2005).

Co więcej, kaspaza-2 posiada zdolność do angażowania mitochondrialnego szlaku apoptotycznego w odpowiedzi na uszkodzenia DNA poprzez permeabilizację zewnętrznej błony mitochondrialnej i/lub poprzez przerwanie asocjacji cytochromu c z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Stąd, komórki trwale transfekowane antysensem prokaspazy-2, lub przejściowo wyrażone siRNA, były oporne na uwalnianie cytochromu c i różne zdarzenia, takie jak aktywacja kaspaz i fragmentacja DNA, indukowane przez uszkodzenia DNA (Lassus i in., 2002; Robertson i in., 2002). Kaspaza-2 może działać pośrednio na mitochondria, na przykład poprzez rozszczepianie proapoptotycznego białka Bid, po czym następuje jego translokacja do mitochondriów w celu indukcji uwalniania cytochromu c (Guo i in., 2002). Dodatkowo, kaspaza-2 może bezpośrednio permeabilizować zewnętrzną błonę mitochondrialną i stymulować uwalnianie cytochromu c i Smac/DIABLO, prawdopodobnie w wyniku bezpośredniej interakcji przetworzonej kaspazy-2 z białkami i/lub fosfolipidami zlokalizowanymi w zewnętrznej błonie mitochondrialnej lub w miejscach kontaktu pomiędzy zewnętrzną i wewnętrzną błoną (Robertson i in., 2004). Permeabilizacja zewnętrznej błony mitochondrialnej wymaga przetwarzania zymogenu kaspazy-2, ale nie związanej z nim aktywności proteolitycznej i zachodzi niezależnie od kilku białek rodziny Bcl-2, w tym Bax, Bak i Bcl-2 (Robertson i in., 2004). Ponadto wykazano, że kaspaza-2 ma zaskakującą zdolność do zakłócania asocjacji między cytochromem c a anionowymi fosfolipidami, zwłaszcza kardiolipiną, dzięki czemu dodatkowy cytochrom c może zostać uwolniony do cytozolu (Enoksson i in., 2004). Ostatnio stwierdzono, że po uszkodzeniu DNA kaspaza-2 aktywuje się w tzw. PIDDosomie, kompleksie składającym się z indukowanego przez p53 białka PIDD zawierającego domenę śmierci, kaspazy-2 i białka adaptorowego RAIDD (Tinel i Tschopp, 2004), co wskazuje na istnienie jądrowo-mitochondrialnego szlaku apoptotycznego.

Dodatkowo doniesiono, że histon H1.2 odgrywa ważną rolę w przekazywaniu sygnałów apoptotycznych z jądra do mitochondriów w następstwie zerwania podwójnej nici DNA (Konishi i in., 2003). Jądrowy histon H1.2 jest uwalniany do cytoplazmy poprzez mechanizm zależny od p53 po przerwaniu podwójnej nici DNA i indukuje uwalnianie cytochromu c z izolowanych mitochondriów w sposób zależny od Bak (Konishi i in., 2003). Zmniejszenie ekspresji H1.2 zwiększało odporność komórek na apoptozę indukowaną przez promieniowanie rentgenowskie lub etopozyd (Konishi i in., 2003).

Co więcej, sierocy receptor jądrowy Nur77 (znany również jako TR3) został ostatnio sprzężony z maszynerią apoptotyczną Bcl-2 w mitochondriach (Lin i in., 2004). Nur77 wiążąc się do N-końcowego regionu pętli Bcl-2, zlokalizowanego pomiędzy domenami BH4 i BH3, indukuje zmianę konformacyjną Bcl-2, która odsłania jej domenę BH3, powodując przekształcenie Bcl-2 z protektora w zabójcę (Lin i in., 2004). Co ciekawe, podwyższony poziom członka rodziny Nur77 był związany z korzystną odpowiedzią na chemioterapeutyki u pacjentów (Shipp i in., 2002).

Ponadto, przy stresie komórkowym, w tym przy stosowaniu leków chemioterapeutycznych, specyficzni proapoptotyczni członkowie rodziny Bcl-2 są aktywowani, pozbawiani lub indukowani, a tym samym działają jak czujniki. Aktywność białek BH3-only jest kontrolowana przez kilka mechanizmów, które utrzymują te białka z dala od wielodomenowych odpowiedników Bcl-2 w normalnych warunkach, ale pozwalają na ich szybką aktywację w warunkach stresu (Bouillet i Strasser, 2002). Jak wspomniano powyżej, białka rodziny Bcl-2, takie jak Bid, Puma czy Noxa, znajdują się pod transkrypcyjną kontrolą supresora nowotworów p53 i w związku z tym ulegają ekspresji w odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA (Oda i in., 2000; Yu i in., 2001; Sax i in., 2002). Białko BH3-only Bim, które jest związane z cytoszkieletem poprzez wiązanie się z mikrotubulami, jest uwalniane i aktywuje szlak wewnątrzpochodny po potraktowaniu taksolem, który działa na agregację mikrotubul (Sunters i in., 2003). Ostatnio wykazano, że paklitaksel indukuje akumulację Bim i zależną od Bim apoptozę w guzach nabłonkowych in vitro, a także in vivo (Tan i in., 2005). Aktywne białka BH3-only wiążą i przeciwdziałają antyapoptotycznym, a w niektórych przypadkach aktywują wielocząsteczkowych proapoptotycznych członków rodziny Bcl-2, prowadząc do utraty przepuszczalności błony mitochondrialnej (Bouillet i Strasser, 2002). Sposób, w jaki białka Bcl-2 indukują zaburzenia zewnętrznej błony mitochondrialnej jest nadal przedmiotem dyskusji i może wiązać się ze zdolnością niektórych białek z rodziny Bcl-2 do tworzenia porów i samooligomeryzacji, modulacją mitochondrialnego porów przepuszczalności (permeability transition pore) przez białka z rodziny Bcl-2 i/lub zmianami lipidów i interakcjami białek lipidowych w obrębie błon mitochondrialnych. Co więcej, środki chemioterapeutyczne, takie jak paklitaksel, powodują hiperfosforylację i inaktywację Bcl-2, a jednocześnie sprzyjają otwarciu porów przejścia przez przepuszczalność (PT) (Ruvolo i in., 2001).

Leki chemioterapeutyczne mogą również indukować lub ułatwiać permeabilizację zewnętrznej błony mitochondrialnej poprzez zmiany w komórkowych potencjałach redoks dzięki zwiększonemu wytwarzaniu reaktywnych form tlenu (lub zmniejszeniu ich detoksykacji), wyczerpaniu zredukowanego glutationu lub wyczerpaniu NADPH, ponieważ megachanał mitochondrialny posiada kilka miejsc wrażliwych na redoks (Debatin i in., 2002). Ponadto, zmiany w metabolizmie energetycznym, na przykład zmniejszenie ilości ADP i ATP, mogą ułatwić otwarcie kompleksu porów przejścia przez przepuszczalność (PTPC), ponieważ ADP i ATP są fizjologicznymi ligandami translokatora nukleotydów adeninowych, które funkcjonują jako endogenne inhibitory PTPC (Costantini i in., 2000). Również odłączenie lub zahamowanie łańcucha oddechowego lub alkalizacja macierzy może sprzyjać permeabilizacji błony mitochondrialnej. Ponadto, przekaźniki lipidowe, takie jak ceramid, który jest generowany w komórkach narażonych na kilka bodźców indukujących apoptozę, w tym leki cytotoksyczne, mogą przyczyniać się do permeabilizacji błony mitochondrialnej (Susin i in., 1997). W wysokich stężeniach. niektóre leki chemioterapeutyczne, na przykład etopozyd lub paklitaksel, mogą również indukować permeabilizację zewnętrznej błony mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach (Robertson i in., 2000; Kidd i in., 2002).

Dodatkowo wykazano, że coraz większa liczba eksperymentalnych leków przeciwnowotworowych, w tym arsenit, lonidamid, syntetyczny retinoid CD437 lub naturalny produkt kwas betulinowy, działa bezpośrednio na mitochondria (Debatin i in., 2002). Na przykład, kwas betulinowy wywołuje apoptozę poprzez bezpośrednie indukowanie utraty potencjału błony mitochondrialnej w izolowanych mitochondriach w sposób, na który nie ma wpływu inhibitor kaspaz Z-VAD-fmk, a jednak jest hamowany przez BA, inhibitor PTPC, lub przez Bcl-2 i Bcl-XL (Fulda i in., 1998b).

Strategie ukierunkowane na szlak wewnątrzpochodny

Białka rodziny Bcl-2

Ponieważ antyapoptotyczne białka Bcl-2, które silnie blokują wewnątrzpochodny szlak apoptozy, występują w podwyższonych poziomach w ludzkich nowotworach zarówno pochodzenia hematologicznego, jak i niehematologicznego (Cotter, 2004), stanowią one obiecujące cele dla interwencji terapeutycznych. W związku z tym opracowano kilka strategii ukierunkowanych na białka Bcl-2, na przykład techniki antysensowe, peptydy z domeną BH3 lub syntetyczne leki małocząsteczkowe zaburzające funkcję białek Bcl-2-podobnych. W celu obniżenia ekspresji Bcl-2 opracowano antysensowne oligonukleotydy Bcl-2 (genasense) firmy Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA). Genasense jest syntetycznym, 18-bazowym, jednoniciowym fosforo-tioinianowym oligonukleotydem, który selektywnie celuje w pierwsze sześć kodonów (tj. 18 zasad) otwartej ramki odczytu mRNA kodującego białko Bcl-2 (Cotter, 2004). Leczenie genasensem znacznie zwiększyło aktywność przeciwnowotworową wielu leków chemioterapeutycznych, na przykład taksanów, antracyklin, alkilatorów lub środków zawierających platynę (Cotter, 2004). W przedklinicznym modelu czerniaka, wstępne traktowanie genasensem zwiększało chemowrażliwość ludzkiego czerniaka (Jansen et al., 1998). Również w badaniu klinicznym genasens działał jako chemosensybilizator dla dakarbazyny u pacjentów z czerniakiem złośliwym (Jansen i in., 2000). Aby zoptymalizować terapię opartą na antysensie, zaprojektowano bispecyficzne oligonukleotydy antysensowe skierowane przeciwko sekwencji, która jest wysoce homogenna w Bcl-2 i Bcl-xL, ale brakuje jej w mRNA Bcl-xS (Zangemeister-Wittke i in., 2000). Jednoczesna redukcja zarówno Bcl-2, jak i Bcl-xL indukowała apoptozę i zwiększała chemiowrażliwość w różnych komórkach nowotworowych (Gautschi i in., 2001; Tortora i in., 2003; Milella i in., 2004; Yamanaka i in., 2005).

Ponadto, peptydy z domeną BH3 lub syntetyczne inhibitory małych cząsteczek zostały opracowane w celu wycelowania w antyapoptotyczne białka Bcl-2-podobne. Domena BH3 składa się z dziewięcioaminokwasowej amfipatycznej helisy α, która wiąże się z kieszenią hydrofobową białek Bcl-2-podobnych (Cory i Adams, 2002). Podobnie, peptydy z domeną BH3 mają na celu zaburzenie tego kompleksu, uwrażliwiając w ten sposób komórki nowotworowe na apoptozę (Letai i in., 2002). Dodatkowo, substytucja domeny Bid BH3 nienaturalnymi aminokwasami na powierzchni przeciwnej do regionu interakcyjnego poprzez zszywanie węglowodorowe doprowadziła do powstania stabilizowanych peptydów BH3 określanych jako SAHBs (stabilized α-helix of Bcl-2 domains), o lepszych właściwościach farmakologicznych (Walensky i in., 2004). Te stabilizowane peptydy BH3 wywoływały apoptozę w różnych białaczkowych liniach komórkowych, a także hamowały wzrost ksenograftów białaczkowych u myszy bez niepożądanych efektów ubocznych (Walensky i in., 2004).

Zidentyfikowano również kilka związków małocząsteczkowych zakłócających funkcję Bcl-2/Bcl-xL. Badania przesiewowe biblioteki związków chemicznych zdolnych do wiązania się do kieszeni BH3 białka Bcl-2 doprowadziły do identyfikacji HA14-1, związku, który konkuruje z Bakiem o wiązanie z Bcl-2 (Wang i in., 2000). Degterev i wsp. (2003), badając bibliotekę 16 320 wstępnie wyselekcjonowanych związków pod kątem zdolności do wypierania fluorescencyjnego peptydu Bak BH3 z Bcl-xL w teście polaryzacji fluorescencyjnej, zidentyfikowali dwie klasy środków zwanych inhibitorami BH3 (BH3Is), które również zaburzają kompleks Bcl-xL z Bax i Bad w nienaruszonych komórkach.

Przy użyciu magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), syntezy równoległej i projektowania opartego na strukturze, odkryto ostatnio małomolekularny inhibitor białek antyapoptotycznych Bcl-2, Bcl-X(L) i Bcl-w, ABT-737. ABT-737 był skuteczny jako pojedynczy środek przeciwko niektórym chłoniakom i guzom litym oraz wykazywał synergistyczną cytotoksyczność z chemioterapeutykami i promieniowaniem (Oltersdorf et al., 2005).

Agoniści Smac/DIABLO

Do projektowania potencjalnie terapeutycznych małych cząsteczek ukierunkowanych na XIAP, rowek wiążący domeny BIR3 XIAP, do którego Smac/DIABLO wiąże się po uwolnieniu z mitochondriów, przyciągnął najwięcej uwagi. Analiza strukturalna dostarczyła jasnych przesłanek do syntezy małych związków, które mogą naśladować aktywność Smac/DIABLO wypierającą kaspazę-9 z BIR3 XIAP (Chai i in., 2000; Wu i in., 2000). W celu zwiększenia dostarczania wewnątrzkomórkowego, peptydy Smac połączono z nośnikiem, na przykład z motywem transdukcji białka HIV Tat (Fulda i in., 2002), sekwencją penetratyny Drosophila antennapaedia (Arnt i in., 2002) lub odcinkiem poliagininowym (Yang i in., 2003b). Stwierdzono, że heptapeptyd reprezentujący N-końcówkę dojrzałego Smac/DIABLO, który jest niezbędny do wiązania się z XIAP, promuje aktywację kaspaz i uwrażliwia różne linie komórek nowotworowych, a także komórki nowotworowe pochodzące od pacjentów pierwotnych na apoptozę indukowaną ligacją receptora śmierci lub lekami cytotoksycznymi (Fulda i in., 2002). Co ważne, peptydy Smac wzmocniły nawet aktywność przeciwnowotworową TRAIL in vivo w wewnątrzczaszkowym modelu ksenograftów glejaka złośliwego (Fulda i in., 2002b). Podobnie, 8-merowy peptyd (AVPIAQKS) sprzężony z domeną transdukcji białka penetratyny Drosophila antennapaedia był zdolny do wnikania do komórek raka piersi, wiązania XIAP i cIAP1 oraz potęgowania aktywności kaspaz indukowanej przez szereg leków przeciwnowotworowych, w tym paklitaksel, etopozyd, 7-etylo-10-hydroksykamptotecynę (SN-38) i doksorubicynę (Arnt i in., 2002). Ponadto, na podstawie trójwymiarowej struktury Smac/DIABLO w kompleksie z XIAP BIR3, zaprojektowano peptydomimetyki Smac, które współdziałając z TRAIL, TNFα, cisplatyną czy etopozydem wyzwalały apoptozę w komórkach nowotworowych (Li i in., 2004; Sun i in., 2004a, 2004b, 2005).

Następnie, niepeptydowi, małocząsteczkowi antagoniści XIAP, którzy zostali uzyskani poprzez przesiewanie biblioteki fagowej lub biblioteki polifenylomoczników, zostali opracowani do celowania w IAP (Schimmer i in., 2004; Wang i in., 2004). Ponadto, produkt naturalny embelin z japońskiego zioła Ardisia został niedawno odkryty jako przepuszczalny dla komórek, niepeptydowy, małocząsteczkowy inhibitor XIAP poprzez oparte na strukturze badania obliczeniowe bazy danych trójwymiarowych struktur tradycyjnych leków ziołowych (Nikolovska-Coleska i in., 2004). Wykazano, że Embelin skutecznie pokonuje ochronny efekt XIAP w komórkach raka prostaty z wysokim endogennym poziomem XIAP lub w komórkach Jurkat transfekowanych XIAP poprzez wiązanie się z domeną BIR3 XIAP (Nikolovska-Coleska i in., 2004). Tak więc agoniści Smac lub niskocząsteczkowi antagoniści XIAP mogą być obiecującymi kandydatami do terapii przeciwnowotworowej poprzez potęgowanie skuteczności terapii cytotoksycznych selektywnie w komórkach nowotworowych.