Abstract
Background. Przetrwała infekcja wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) jest niezbędnym elementem w procesie nowotworzenia raka szyjki macicy. Naszym celem było oszacowanie częstości utrzymywania się infekcji HPV po wycięciu dużej pętli w strefie transformacji (LEEP) u pacjentek ze zmianami śródnabłonkowymi o wysokim stopniu złośliwości (HSIL) oraz zbadanie, czy utrzymywanie się infekcji HPV jest związane z jej typem. Metody. Przeprowadziliśmy prospektywne badanie na 89 pacjentkach z HSIL leczonych metodą LEEP. Badanie DNA HPV wykonano przed zabiegiem oraz w 6, 12 i 18 miesiącu po LEEP. Wyniki. Cztery pacjentki zostały wyłączone z badania. Przetrwałość HPV u pozostałych 85 pacjentek wynosiła 32,95% (6 miesięcy), 14,12% (12 miesięcy) i 10,59% (18 miesięcy). Typ 16 miał najwyższy wskaźnik trwałości, 23,5% (6 miesięcy), 11,8% (12 miesięcy) i 8,2% (18 miesięcy). Koinfekcję stwierdzono u 54,12% przed LEEP oraz u 18,8% (6 miesięcy), 4,7% (12 miesięcy) i 3,5% (18 miesięcy) po LEEP. Częstość koinfekcji obejmujących typ 16 wynosiła 46,83% wszystkich koinfekcji. Współzakażenie obejmujące typ 16 nie było skorelowane z wyższym odsetkiem przetrwałości w porównaniu z zakażeniem samym typem 16. Wnioski. Zakażenie HPV nie ulega całkowitej eradykacji po LEEP u pacjentek ze zmianą HSIL w rozmazie PAP. Na utrzymywanie się zakażenia HPV po LEEP wpływa typ HPV. HPV typu 16 ma najwyższy wskaźnik trwałości.
1. Wprowadzenie
Przetrwałe zakażenie wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) jest niezbędnym wydarzeniem w nowotworzeniu raka szyjki macicy. Praktycznie wszystkie komórki nowotworowe w raku szyjki macicy zawierają sekwencje wirusa HPV. HPV jest najczęstszą chorobą przenoszoną drogą płciową na świecie. Większość zakażeń ma charakter przemijający, do 70% ulega regresji w pierwszym roku i do 90% w ciągu 2 lat; 10-20% zakażeń utrzymuje się, umożliwiając ewolucję zmian przednowotworowych do raka. Tylko 40 z 200 znanych genotypów HPV wykazuje tropizm dla błony śluzowej anogenitalnej, a 18 z tych 40 typów jest bezpośrednio związanych z rakiem szyjki macicy. Piętnaście typów HPV zostało zdefiniowanych jako typy HR-HPV (high risk-human papilloma virus) o silnym potencjale onkogennym: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 i 82. Te typy HR-HPV odpowiadają za 95% wszystkich przypadków raka szyjki macicy. Równoczesne zakażenia wieloma typami HPV są powszechne .
HPV 16 i 18 są najczęstszymi typami HR-HPV na świecie i odpowiadają za około 70% wszystkich raków płaskonabłonkowych (SCC) i do 85% wszystkich gruczolakoraków. HPV 16 jest najbardziej kancerogennym genotypem HPV, a HPV 18 powoduje większy odsetek raków gruczołowych w porównaniu z rakiem płaskonabłonkowym. Po HPV 16 i 18, sześć najbardziej rozpowszechnionych typów, które stanowią dodatkowe 20% to typy 31, 33, 35, 45, 52 i 58 .
Wycięcie szyjki macicy, takie jak wycięcie dużej pętli strefy transformacji (LEEP) jest nie tylko procedurą diagnostyczną, ale także odpowiednim leczeniem śródnabłonkowej neoplazji szyjki macicy (CIN) . Jednak po takim leczeniu CIN może dojść do nawrotu CIN i rozwoju inwazyjnego raka szyjki macicy. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że badanie na obecność wirusa brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka (HR-HPV) po LEEP może pomóc w przewidywaniu prawdopodobieństwa przetrwania lub nawrotu choroby.
Celem naszego badania było oszacowanie wskaźnika przetrwania infekcji HPV po LEEP u pacjentek ze zmianami płaskonabłonkowymi wysokiego stopnia (HSIL) i zbadanie, czy przetrwanie HPV jest związane z typem.
2. Materiały i metody
Wybór pacjentek. Przeprowadziliśmy badanie prospektywne. Do badania włączono wszystkie pacjentki z cytologią HSIL w rozmazie PAP, które zostały skierowane na LEEP do Kliniki Położnictwa i Ginekologii Uniwersytetu Medycyny i Farmacji „Victor Babeş”, Timişoara, w okresie od stycznia 2010 do maja 2014 roku. Konwencjonalna cytologia została wykonana i oceniona zgodnie z kryteriami Bethesda 2001. Wszystkie pacjentki oceniono za pomocą kolposkopii i zastosowano kryteria Międzynarodowej Federacji Patologii Szyjki Macicy i Kolposkopii (International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy – IFCPC). Wszystkie pacjentki poddano LEEP pod kontrolą kolposkopową po zastosowaniu roztworu Lugola. Podczas zabiegu wycinano wszystkie nieprawidłowości stwierdzone kolposkopowo, dążąc do uzyskania głębokości tkanki co najmniej 6 mm. Wszystkie zabiegi były wykonywane przez ten sam zespół chirurgów. Testy DNA HPV były wykonywane przed LEEP we wszystkich przypadkach. Testy DNA HPV powtórzono po 6, 12 i 18 miesiącach od LEEP. Pacjentki, u których testy DNA HPV przed LEEP były negatywne, zostały wykluczone z badania. Wszystkie próbki były badane przy użyciu testu LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test (CE-IVD), opartego na odwrotnej hybrydyzacji amplikonów. DNA 37 typów HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 i CP6108) wykrywano w próbkach szyjki macicy metodą multipleks PCR ukierunkowaną na konserwatywny region L1 genomu wirusa. Do badania genotypu użyto Gene Amp PCR System 9700 zgodnie z instrukcją producenta. Automatyczna hybrydyzacja i detekcja DNA HPV została przeprowadzona na ProfiBlot 48 (Tecan Trading AG, Zurich, Szwajcaria).
Wszystkie próbki zostały wysłane do badania histopatologicznego. Pacjentki z dodatnimi marginesami resekcji po LEEP zostały wykluczone z badania.
Informacyjna zgoda została uzyskana od wszystkich pacjentek przed włączeniem ich do badania. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z normami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej z 1964 roku i jej późniejszymi zmianami i zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board i Komitet Etyczny Uniwersytetu Medycyny i Farmacji „Victor Babeş”, Timişoara.
Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu SPSS v17 i Epi Info 7. Do obliczania wartości zastosowano testy nieparametryczne (Wilcoxon sign rank i chi kwadrat).
3. Wyniki
Do naszej kliniki skierowano 89 pacjentek z HSIL w rozmazie PAP. Po pierwszym badaniu DNA HPV u 2 pacjentek wynik był ujemny i zostały one wyłączone z badania. Wykluczyliśmy te pacjentki, ponieważ chcieliśmy zbadać utrzymywanie się HPV po LEEP. Ponieważ nie było zakażenia przed LEEP, wykluczyliśmy tych pacjentów z badania.
Inne 2 pacjentki miały dodatnie marginesy na próbce LEEP i również zostały wykluczone z badania. U pozostałych 85 pacjentów przeprowadzono testy DNA HPV w 6, 12 i 18 miesiącu po LEEP. Wszystkie pozostałe pacjentki były pozytywne dla HR-HPV przed LEEP. Typy HPV wykryte przed LEEP stanowiły 50,6% typu 16, 24,7% typu 18, 20% typu 31, 24,7% typu 33, 11,8% typu 35, 7,1% typu 45, 27,1% typu 52, 9,4% typu 58, 9,4% typu 6, 5,9% typu 11 i 5,9% innych typów. W 6 miesięcy po LEEP całkowity czas utrzymywania się choroby wynosił 32,95% (28 pacjentów), w 12 miesięcy 14,12% (12 pacjentów), a w 18 miesięcy 10,59% (9 pacjentów). Częstość utrzymywania się wirusa w naszej grupie po 6, 12 i 18 miesiącach dla każdego typu HPV przedstawiono w tabeli 1. Przetrwałość wirusa w 12 i 18 miesiącu obserwowano tylko u pacjentek dodatnich w 6 miesiącu. Typ 16 charakteryzował się najwyższą trwałością, 23,5% po 6 miesiącach, 10,6% po 12 miesiącach i 8,2% po 18 miesiącach. Typ 16 był związany z istotnie zwiększonym ryzykiem utrzymywania się choroby w porównaniu z innymi typami wysokiego ryzyka (tab. 2).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Różnice istotne (przy 0.05; 0,01; i 0,001). Różnice nieistotne (przy poziomie istotności 0,05). Z drugiej tabeli wynika, że najczęściej występującym typem HPV jest 16. Co więcej, ten typ HPV wydaje się być najbardziej uporczywy i niebezpieczny. Widzimy, że istnieją niezwykle istotne różnice między HPV 16 a innymi typami HPV, w większości przypadków. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Koinfekcje, definiowane jako obecność więcej niż jednego typu HPV, stwierdzono u 54,12% przed LEEP, 18,8% w 6 miesiącu, 4,7% w 12 miesiącu i 3,5% w 18 miesiącu po LEEP (tab. 1). Koinfekcje, w tym typ 16, stanowiły 46,83% wszystkich koinfekcji. U pacjentów z dodatnim typem 16 stwierdzono istotnie wyższe ryzyko utrzymywania się infekcji niż u pacjentów z infekcją lub koinfekcją innymi typami (tabele 3 i 4). Koinfekcja z typem 16 nie korelowała z wyższą częstością utrzymywania się zakażenia niż koinfekcja tylko z typem 16 (tab. 5).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Dyskusja
Rak szyjki macicy pozostaje główną przyczyną zachorowalności i umieralności kobiet na całym świecie. Jest on spowodowany przez nabycie i utrzymywanie się typów zakażenia wirusem brodawczaka ludzkiego wysokiego ryzyka (HR-HPV) i następową złośliwą transformację komórek nabłonka szyjki macicy. Przetrwałe zakażenie HPV jest głównym czynnikiem rozwoju CIN. W 2013 roku Jaisamrarn i wsp. zbadali naturalną historię progresji infekcji HPV do zmian w szyjce macicy lub jej usunięcia. Stwierdzili oni, że ogólnie 53%, 79%, 87% i 89% wszystkich infekcji HPV zostało oczyszczonych odpowiednio po 12, 24, 36 i 48 miesiącach, oraz że prawdopodobieństwo oczyszczenia z HPV 16 i HPV 31 było znacząco mniejsze niż w przypadku nieonkogennych HPV . Trwałość zakażenia HPV wysokiego ryzyka jest kluczowym czynnikiem rozwoju raka szyjki macicy, a wykrycie trwałości wirusa może być wykorzystane do identyfikacji kobiet z największym ryzykiem zachorowania na raka szyjki macicy.
Wycięcie szyjki macicy jest uważane zarówno za procedurę diagnostyczną, jak i terapeutyczną, która może skutecznie wyeliminować zakażenie HR-HPV i CIN. Pomimo usunięcia całej zmiany przez wycięcie stożka z ujemnymi marginesami, infekcja HPV może utrzymywać się w niektórych przypadkach. Badania dotyczące usuwania/utrwalania zakażenia HPV po LEEP wykazały, że wiek, stopień zaawansowania zmiany i stan marginesów są czynnikami ryzyka dla przetrwania zakażenia HPV. U nas odsetek utrzymywania się zakażenia po 6 miesiącach wynosił 32,95%. Inni autorzy, stosujący tę samą procedurę, podali niższe wskaźniki utrzymywania się HPV po 6 miesiącach, wahające się od 14,3% do 21,5%. Uważamy, że wybór tylko pacjentek z HSIL i fakt, że wszystkie pacjentki w naszym badaniu miały infekcje HR-HPV są odpowiedzialne za nasz wyższy wskaźnik persystencji. Park et al. i Nam et al. również stwierdzili, że zmiany o wysokim stopniu zaawansowania są czynnikami ryzyka dla przetrwania HPV po LEEP .
Wyłączyliśmy pacjentów z dodatnimi marginesami po resekcji z naszego badania, ponieważ chcieliśmy zbadać trwałość infekcji HPV u pacjentów z ujemnymi marginesami. Obecność dodatnich marginesów jest uważana za główny czynnik przetrwania HPV oraz nawrotu i progresji choroby. Alonso i wsp. 2006 stwierdzili, że dodatnie marginesy stożka były istotnie związane z wyższym ryzykiem nawrotu choroby. Wybraliśmy pacjentki z HSIL, ponieważ są one bardziej narażone na infekcję HPV typami wysokiego ryzyka, a zmiany HSIL są bardziej narażone na progresję do choroby inwazyjnej. Wykluczyliśmy pacjentów z ujemnym DNA HPV przed LEEP, ponieważ naszym celem było zbadanie trwałości infekcji HPV po LEEP.
Kilku autorów zbadało i stwierdziło, że wiremia przed LEEP jest czynnikiem ryzyka dla trwałości HPV. Wysokie ładunki wirusowe, RLU/PC ≥ 100, zostały uznane za czynniki ryzyka dla trwałości HPV i nawrotu choroby. Ponieważ pomiar wiremii HPV nie jest powszechnie dostępny, zbadaliśmy, czy ryzyko utrzymywania się HPV po LEEP jest związane z określonymi typami HPV. Uważamy to za pomocne w stratyfikacji ryzyka i wyborze grupy pacjentów, którzy powinni być oceniani bardziej uważnie. Skupiliśmy się na uporczywości związanej z typem, ponieważ DNA HPV jest szerzej stosowanym testem niż ocena wiremii HPV.
Zidentyfikowanie tego samego typu HPV przed i po LEEP było uważane za uporczywość. Nie znaleźliśmy nowych typów HPV po LEEP u żadnego pacjenta. Utrzymywanie się wirusa po 12 i 18 miesiącach stwierdzono tylko u pacjentek z wynikiem dodatnim po 6 miesiącach od LEEP. Uważamy, że prawdopodobieństwo reinfekcji w trakcie badania jest niskie, choć trudno je całkowicie wykluczyć.
W naszym badaniu HPV typ 16 okazał się czynnikiem sprzyjającym utrzymywaniu się HPV po LEEP. Nasze wyniki są zgodne z wynikami Nam i wsp. 2009, którzy badali czynniki związane z utrzymywaniem się HPV po konizacji w podobnej grupie (77 chorych) i stwierdzili, że przedoperacyjne zakażenie HPV typu 16 było jedynym istotnym niezależnym czynnikiem () dla utrzymywania się HPV poza wiekiem, cytologią, histologią biopsji punkcyjnej, wiremią HPV i histologią konizacji.
Nasze wyniki wskazują również, że większość zakażeń HPV ulega usunięciu w ciągu 12 miesięcy po operacji, a bardzo niewiele ulega usunięciu po tym okresie. Sugerujemy, że punktem końcowym obserwacji HPV DNA po LEEP powinno być 12 miesięcy. Uważamy również, że u pacjentów z utrzymującym się zakażeniem po 12 miesiącach bardziej prawdopodobne jest wystąpienie progresji choroby niż wyleczenie zakażenia, ale do udowodnienia tego stwierdzenia potrzeba więcej danych. Sugerujemy, że HPV DNA po 12 miesiącach od LEEP może być użytecznym narzędziem do identyfikacji pacjentek, u których prawdopodobnie wystąpi progresja choroby.
Persistence lub klirens HPV DNA jest uważany za wczesny, ważny marker prognostyczny niepowodzenia lub wyleczenia po leczeniu dysplazji szyjki macicy i jest bardziej dokładny niż cytologia lub status marginesu przekroju w czasie LEEP. Zgodnie z metaanalizą przeprowadzoną przez Kocken i wsp. 2012 test HPV powinien być włączony do badań poterapeutycznych 6 miesięcy po leczeniu, ponieważ ma wyższą czułość niż cytologia w wykrywaniu choroby wysokiego stopnia po leczeniu i ma podobną swoistość. Nawrót dysplazji szyjki macicy po LEEP jest również związany z utrzymywaniem się wirusa HPV. Kilku badaczy przeanalizowało czułość i swoistość testów DNA HPV w porównaniu z cytologią uzupełniającą w celu dokładniejszego wykrywania choroby resztkowej/nawrotowej po leczeniu. Stwierdzono, że testy HPV są bardziej czułe niż cytologia kontrolna, przy porównywalnej swoistości. Kobiety, które są HPV pozytywne po operacji są na większe ryzyko niepowodzenia leczenia .
Zauważyliśmy utrzymywanie się typów 6 i 11 w 12 miesięcy. Te typy nie są uważane za typy wysokiego ryzyka, ale są związane z kłykcinami kończystymi .
Zainteresowanie koinfekcją wieloma typami HPV wzrosło w ostatnich latach, wraz z możliwością szczepienia, a także z powodu odkrycia, że odpowiedź immunologiczna wydaje się być specyficzna dla danego typu .
Częstość koinfekcji podawana w literaturze jest zmienna i waha się od 19% do 43,2%. Wynika to z czynników takich jak wiek, zachowania seksualne, odpowiedź immunologiczna i metoda wykrywania HPV. Nasz wskaźnik koinfekcji wyniósł 54,12%, a wskaźnik koinfekcji obejmujący typ 16 wyniósł 46,83% wszystkich koinfekcji .
W badaniu przeprowadzonym na 1124 pacjentach Liaw i wsp. stwierdzili, że HPV 16 utrzymywał się dłużej niż inne typy, ale nie zmieniał on późniejszej trwałości innych współistniejących infekcji HPV. Zgadza się to z naszymi wynikami, że typ 16 ma najwyższy wskaźnik trwałości (tab. 2). Stwierdziliśmy również, że koinfekcja z typem 16 ma wyższy wskaźnik trwałości niż koinfekcja bez typu 16 (Tabela 3). Współzakażenie z typem 16 nie było skorelowane z wyższą trwałością w porównaniu z zakażeniem samym typem 16 (Tabela 5). Wskazuje to, że obecność typu 16 jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na trwałość zakażenia .
Mocne strony badania są reprezentowane przez prospektywny charakter badania i fakt, że tylko pacjenci z HSIL zostali wybrani. W ten sposób zbadano właśnie tę kategorię chorych, u których istnieje prawdopodobieństwo zakażenia HR-HPV i które są narażone na nawrót po LEEP i progresję choroby do raka.
5. Conclusions
HPV infection is not completely eradicated by LEEP in patients with HSIL lesion on PAP smear. Na utrzymywanie się HPV po LEEP ma wpływ typ HPV. HPV typu 16 ma najwyższy wskaźnik utrzymywania się.
Nasze wyniki zdecydowanie przemawiają za wprowadzeniem testu DNA HPV do obserwacji chorych, u których wykonano LEEP z powodu HSIL, zwłaszcza jeśli HPV typu 16 został zidentyfikowany przed LEEP.
Dodatkowe punkty
Nazwa rejestru to Laurențiu Pirtea.
Konflikt interesów
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Acknowledgments
This paper was supported by Grant PII-C2-TC-2014-06, University of Medicine and Pharmacy „Victor Babeş”, Timişoara, Romania.
Materiały uzupełniające
Dane wykorzystane do analizy statystycznej dotyczące zakażenia HPV badanym HPV-DNA, określone przed LEEP (1 = obecny, 0 = nieobecny) oraz w 6, 12 i 18 miesiącu po LEEP, a także wiek badanych pacjentek.
- Materiały uzupełniające
.