Kwasy nukleinowe
Podobnie jak wiele cząsteczek biologicznych kwasy nukleinowe są polimerami, długimi cząsteczkami utworzonymi z powtarzających się jednostek. W przypadku kwasów nukleinowych, powtarzającą się jednostką jest nukleotyd. Nukleotyd składa się z pięciowęglowego cukru, zasady zawierającej azot i grupy fosforanowej. Dwa podstawowe rodzaje kwasów nukleinowych, kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) i kwas rybonukleinowy (RNA), posiadają nieco inne cukry w odpowiednich nukleotydach i inny zestaw czterech zasad, które mogą być zawarte w ich nukleotydach.
 |
 |
| DNA Nukleotyd | |
 |
|
| Nukleotyd RNA | Struktura odcinka cząsteczki RNA. |
Uwaga na obecność grupy hydroksylowej na węglu 2′ moetu cukrowego.
|
|
 |
 |
| Adenina -. DNA i RNA |
Guanina – DNA i RNA |
Tymina -.
DNA i RNA |
 |
 |
|
| Cytozyna -. DNA i RNA |
Uracyl – Tylko RNA |
Wielkie znaczenie dla elektroforezy ma jonizacja grup fosforanowych, dając kwasom nukleinowym duży ujemny ładunek netto. Ponieważ każdy nukleotyd jest zjonizowany, stosunek ładunku do masy dwóch różnych cząsteczek kwasu nukleinowego będzie bardzo zbliżony.
 |
 |
| Grupy fosforanowe każdego nukleotydu niosą ujemny ładunek formalny. Ponieważ każdy nukleotyd niesie ten sam ładunek, stosunek ładunku do masy różnych cząsteczek kwasu nukleinowego jest prawie identyczny. Siła elektryczna powoduje, że ujemnie naładowane cząsteczki kwasu nukleinowego migrują w kierunku bieguna dodatniego. | |
DNA i RNA zawierają po cztery możliwe nukleotydy odpowiadające zestawowi czterech możliwych zasad (adenina, guanina, tymina i cytozyna dla DNA; adenina, guanina, uracyl i cytozyna dla RNA). Każda z zasad wykazuje szczególne powinowactwo do jednej z pozostałych trzech zasad, oparte na symetrii wiązań wodorowych. Zasada azotowa adenina „łączy się w pary” z tyminą (lub uracylem w RNA). Guanina „łączy się w pary” z cytozyną. Ze względu na parowanie zasad, DNA i RNA mogą istnieć jako warianty jednoniciowe lub dwuniciowe. Forma dwuniciowa składa się z dwóch komplementarnych nici połączonych przez parowanie zasad.
Parowanie zasad dwóch komplementarnych nici pozwala cząsteczkom kwasu nukleinowego przyjąć formę dwuniciową.
Parowanie zasad może również występować w jednoniciowym DNA lub RNA. Część zawierająca jedną sekwencję nukleotydów często zapętla się i łączy w pary zasadowe z częścią komplementarną na tym samym łańcuchu. Wpłynie to na trójwymiarową strukturę cząsteczki, co będzie miało wpływ na rozdział elektroforetyczny. Ogólnie rzecz biorąc, długie nici DNA lub RNA będą występować w konformacji sparowanej zasadami, albo dwuniciowej, albo jednoniciowej z wewnętrznym parowaniem. Niesparowane lub „zdenaturowane” kwasy nukleinowe występują w roztworze tylko w specjalnych warunkach, które destabilizują pary zasad.
Parowanie zasad nie jest ograniczone do wariantów dwuniciowych, ale może również występować w obrębie tej samej cząsteczki. Powstałe w ten sposób konformacje mogą prowadzić do trudnych do interpretacji wyników elektroforezy.
Elektroforeza dwuniciowego DNA lub RNA jest określana jako natywna elektroforeza żelowa. Elektroforeza jednoniciowego DNA lub RNA zachodzi w warunkach denaturujących. Formamid i mocznik są dwoma najbardziej powszechnymi środkami, które dokonują chemicznej denaturacji. Substancje te zaburzają wiązanie wodorowe pomiędzy zasadami azotowymi, usuwając w ten sposób efekt parowania zasad. Zazwyczaj w procesie elektroforezy denaturującej, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na prowadzeniu żelu, stosuje się jakąś kombinację formamidu, mocznika i ciepła. Celem warunków denaturujących jest zapewnienie jednoniciowości cząsteczek i zapobieganie zmianom konformacyjnym spowodowanym parowaniem zasad pomiędzy różnymi odcinkami tej samej cząsteczki DNA lub RNA. Denaturujące warunki elektroforezy pozwalają na zachowanie stałego związku pomiędzy wielkością cząsteczki a jej ruchliwością w żelu.
Formamid i mocznik dokonują denaturacji DNA lub RNA przez tworzenie nowych wiązań wodorowych z zasadami cząsteczek kwasów nukleinowych, przerywając wiązania wodorowe, które prowadzą do parowania zasad.
NEXT TOPTIC: Makrocząsteczki biologiczne – kwasy nukleinowe
.