Wirusy i komórki
Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie eksperymenty przeprowadzono z użyciem klinicznego izolatu wirusa grypy w komórkach MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1) uprzejmie dostarczonego przez dr Roberta Webstera (St. Jude Children’s Hospital, USA) . Wirusy opisane na ryc. 5 zostały uprzejmie dostarczone przez współpracowników wymienionych w Podziękowaniach.
Komórki MDCK i komórki MDCK-SIAT1 stabilnie transfekowane 2,6-sialylotransferazą w celu zwiększenia ekspresji oligosacharydów zakończonych Neu5Ac2-6Gal zostały opisane wcześniej. Oba typy komórek namnażaliśmy w DMEM (Gibco) uzupełnionym 2 mM L-glutaminą, 10% płodową surowicą cielęcą i antybiotykami (streptomycyną, 100 mg/ml i penicyliną, 100 U/ml).
Overlay media
Jako płynne medium podtrzymujące (MM) do infekcji wirusem, użyliśmy MEM Eagle’a zawierającego L-glutaminę, 0,1% BSA (Sigma, A-0336), antybiotyki i 1 μg/ml trypsyny TPCK (Sigma, T-1426).
Składy 1,8% Bacto-Agar (BD, 214010) i 2% metylocelulozy (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s przy 2%, Fluka) w wodzie destylowanej przygotowano jak opisano wcześniej .
Producent Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) uprzejmie dostarczył trzy rodzaje Avicel (RC-581, RC-591 i CL-661) do badań. Przygotowaliśmy zawiesiny Avicelu, rozpraszając 2,4 g proszku Avicelu w 100 ml wody destylowanej na standardowym mieszadle magnetycznym przez 1 godz. Zapasy agaru, MC i Avicelu sterylizowano przez autoklawowanie przez 20 min w 121°C i przechowywano w temperaturze pokojowej.
Nakładki przygotowywano mieszając roztwory MC, Avicelu lub stopionego agaru z równymi objętościami podłoża konserwującego o podwójnej mocy. Aby zmienić stężenie MC i Avicelu w nakładkach, rozcieńczaliśmy oryginalne zapasy sterylną wodą. Nakładki agarowe przygotowywano w temperaturze 42-44°C, dwie inne nakładki przygotowywano w temperaturze 20 lub 37°C.
Stężone (2,4%) zapasy Avicelu zwykle nie rozdzielały się podczas przechowywania, rozcieńczone nakładki na bazie Avicelu były jednak mniej stabilne. Jeśli uznano to za konieczne, wymieszaliśmy zapasy Avicelu i zawsze mieszaliśmy nakładki Avicelu przed użyciem przez potrząsanie ręką lub worteksowanie. Powolne rozdzielanie nakładek po ich nałożeniu na monowarstwy komórkowe nie miało wpływu na wyniki oznaczeń.
Atest płytkowy w płytkach 6-dołkowych
Jedną godzinę po zainfekowaniu monowarstw komórkowych 30-50 jednostkami plaque forming wirusa w 1 ml pożywki konserwującej bez trypsyny, usunęliśmy inokulum wirusa, pokryliśmy komórki 3 ml różnych pożywek nakładkowych i inkubowaliśmy hodowle w temperaturze 35°C w atmosferze 5% CO2. W przypadku nakładek MC i Avicel zwracano uwagę, aby nie naruszać płytek w czasie inkubacji, aby uniknąć tworzenia się nierównych blaszek. Po trzech dniach inkubacji usuwano nakładki i utrwalano komórki. Nakładki agarowe usuwano za pomocą metalowej szpatułki; nakładki MC, Avicel i płynne usuwano przez odsysanie. Komórki utrwalano 4% roztworem paraformaldehydu w MEM przez 30 min w temp. 4°C i przemywano PBS. Wszystkie kolejne zabiegi na komórkach wykonywano w temperaturze pokojowej. Permeabilizowaliśmy komórki i jednocześnie blokowaliśmy resztkowe grupy aldehydowe poprzez inkubację komórek przez 10-20 min z 1 ml/basenik roztworu zawierającego 0,5% Triton-X-100 i 20 mM glicynę w PBS. Komórki zakażone wirusem barwiliśmy immunologicznie poprzez inkubację przez 1 godz. z przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla nukleoproteiny wirusa grypy A (uprzejmie dostarczonymi przez dr Alexandra Klimova z Centers for Disease Control, USA), a następnie przez 1 godz. inkubację z przeciwciałami anty-mysimi znakowanymi peroksydazą (DAKO, Dania) i 30 min inkubację z substratami peroksydazy tworzącymi precypitat. Roztwór 10% normalnej surowicy końskiej i 0,05% Tween-80 w PBS był używany do przygotowania roboczych rozcieńczeń immuno-odczynników. Po podaniu przeciwciał pierwszo- i drugorzędowych komórki przemywano, inkubując je trzykrotnie przez 3-5 min z 0,05% Tween-80 w PBS. Jako substraty peroksydazowe stosowaliśmy gotowy do użycia True Blue™ (KPL) lub roztwór aminoetylokarbazolu (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) przygotowany w 0,05 M buforze octanowo-sodowym, pH 5,5 i zawierający 0,03% H2O2. Zabarwione płytki przemywano wodą z kranu w celu zatrzymania reakcji i suszono. W przypadku barwienia True Blue, które jest stosunkowo niestabilne w roztworach wodnych, płytki suszono w pozycji odwróconej, aby zminimalizować wybielanie. Barwione płytki skanowano na skanerze płaskim, a dane pozyskiwano za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop 7.0.
Alternatywnie do barwienia immunologicznego, w niektórych eksperymentach ujawnialiśmy blaszki miażdżycowe jako obszary zniszczonych komórek. W tym celu, po usunięciu nakładek, wybarwialiśmy komórki 1% roztworem fioletu krystalicznego w 20% metanolu w wodzie.
Warianty miareczkowania wirusa w płytkach 96-dołkowych
1. Wariant standardowy
Infekowaliśmy monowarstwy komórek MDCK lub MDCK-SIAT1 na płytkach 96-dołkowych za pomocą 50 μl/basenik seryjnych rozcieńczeń wirusa w pożywce konserwującej bez trypsyny. Po 1 h inkubacji w 35°C w 5% CO2, usuwaliśmy wirusa, dodawaliśmy 100 μl/basenik podłoża MC lub Avicel i inkubowaliśmy komórki przez kolejne 24 h, aby umożliwić tworzenie się płytek. Utrwalanie i barwienie immunologiczne przeprowadzono w sposób opisany powyżej dla płytek 6-dołkowych, ale z użyciem 50 μl odczynników na studzienkę.
2. wariant uproszczony
Badanie przeprowadzono dokładnie tak, jak w wariancie standardowym z następującymi modyfikacjami. Po 1 h inkubacji z wirusem, nie usuwaliśmy inokulum. Dodawaliśmy 100 μl/basenik podłoża Avicel i mieszaliśmy płytkę albo stukając w nią ręką, albo używając miksera płytkowego. Pożywka zawierała zwiększoną ilość trypsyny (1,5 μg/ml), aby skompensować rozcieńczenie nakładki materiałem zawierającym wirusa obecnym w studzienkach.
Test hamowania plazmy
Noel Roberts (Roche Products, UK) uprzejmie dostarczył karboksylan oseltamiwiru (OC) jako inhibitor neuraminidazy. Dodawaliśmy 50 μl/basenik seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń OC w pożywce konserwującej bez trypsyny (zakres stężeń od 4 nM do 400 μM OC) do monowarstw komórek MDCK-SIAT1 na płytkach 96-dołkowych. Następnie dodawaliśmy rozcieńczenia wirusa (20-40 plaque forming units na dołek) w ilości 50 μl/dołek. Płytki wymieszaliśmy i inkubowaliśmy przez 1 h w temp. 35°C, aby umożliwić inicjację infekcji wirusowej. Następnie dodawaliśmy 100 μl/basenik 1,2% podłoża Avicel zawierającego 2 μg/ml trypsyny, inkubowaliśmy hodowle przez 24 h i utrwalaliśmy oraz barwiliśmy immunologicznie, jak opisano powyżej.
W przypadku płytek 6-dołkowych dodawaliśmy 0,75 ml porcji leku i inhibitora oraz 1,5 ml porcji Avicel na dołek i barwiliśmy immunologicznie płytki 3 dni po zakażeniu.