Dyskusja
Buprenorfina jest jednym z leków niewstrzykiwanych, najczęściej zmienianym przez użytkowników narkotyków. Per os, buprenorfina ulega intensywnemu metabolizmowi wątrobowemu pierwszego przejścia, który jest odpowiedzialny za biodostępność na poziomie około 20%. Bezwzględna biodostępność podjęzykowa buprenorfiny może sięgać od 30% do 55%, w zależności od badanych. Samodzielne wstrzykiwanie leku znacznie zwiększa podawane dawki, a tym samym zwiększa odczuwane efekty, ale także związane z nimi ryzyko. We Francji polityka ograniczania ryzyka związanego z przyjmowaniem narkotyków drogą iniekcji wykazała swoją wartość w zmniejszaniu częstości występowania zgonów z powodu przedawkowania i chorób zakaźnych (HIV, CHV…). Główne działania podejmowane w ciągu ostatnich 30 lat opierały się na ograniczaniu ryzyka zakażeń, poprzez zezwolenie na sprzedaż strzykawek bez recepty w aptekach, a następnie poprzez dostarczanie zestawów profilaktycznych (Steribox). Urządzenia te ewoluowały w zależności od epidemii, z którymi borykali się użytkownicy narkotyków: VIH, HBV i HCV. Poza ryzykiem zakaźnym, inne niepokojące problemy związane są z wstrzykiwaniem nierozpuszczalnych cząstek: zapalenie żył, zatorowość płucna, syndrom „obrzmiałej ręki” … -. Aby zapobiec wystąpieniu tych powikłań, konieczne stało się filtrowanie wstrzykiwanych roztworów. Po koniec lat 90-tych dostarczono użytkownikom różne rodzaje filtrów – sterylne filtry bawełniane dostępne w opakowaniach Steribox i Sterifilt, które zostały dostarczone do Centrów Recepcji i Wsparcia Redukcji Szkód dla osób używających narkotyków (CAARUD), a także do innych struktur o niskim progu popytu lub struktur redukcji szkód. Filtry bawełniane są stosunkowo łatwe w użyciu, ale mają dwie główne wady: przepuszczają duże cząstki w roztworze (prawdopodobnie włókna bawełny) i mają dużą objętość pustej przestrzeni, co powoduje utratę substancji prowadzącą do zwiększonego nadużywania filtrów (sprzedaż, dzielenie się, ponowne użycie, „wyciskanie”). Ponieważ Sterifilt ma 10 µm odcięcia, zatrzymuje większość dużych cząstek i ma bardzo małą objętość martwą, ale jest trudniejszy w użyciu. Określenie „ekstrahowalności” buprenorfiny nie było do tej pory badane w warunkach rzeczywistego użycia. Ilość buprenorfiny zatrzymanej przez filtry bawełniane jest większa niż w przypadku Sterifilt, co przekłada się na mniejsze dawki iniekcyjne (po filtracji przez filtry bawełniane) w porównaniu do Sterifilt. Wyniki te można porównać do tych uzyskanych w przypadku heroiny . Jednakże, buprenorfina jest doskonałym kandydatem do wstrzyknięcia, ponieważ niezależnie od warunków filtracji, co najmniej 70% dawki jest odzyskiwane i dlatego może być wstrzykiwane. Głównym pytaniem, na które chcieliśmy odpowiedzieć, jest pochodzenie skórnych zmian martwiczych, głównie livedopodobnego zapalenia skóry (LLD), obserwowanego prawie wyłącznie podczas wstrzykiwania generyku. Obecnie patogeneza LLD nie została do końca wyjaśniona. Pierwsze przypadki wystąpienia zespołu Nicolau po domięśniowym wstrzyknięciu soli bizmutu w celu leczenia kiły pochodzą z XX wieku. Większość przypadków LLD odnotowano po domięśniowym wstrzyknięciu niesteroidowych leków przeciwzapalnych, antybiotyków (penicylin, aminoglikozydów) lub glikokortykoidów, a ostatnio po samodzielnym wstrzyknięciu etanerceptu. Dlatego te martwicze zmiany skórne pojawiają się zawsze po iniekcji (tętniczej, okołotętniczej lub okołonerwowej) i są różnie związane z martwicą i/lub zatorowością/ niedokrwieniem -. Wcześniej przedstawiono trzy doniesienia o LLD po wstrzyknięciu buprenorfiny, potwierdzone wynikami badań histologicznych -. Wszystkie przypadki miały miejsce w kontekście iniekcji wewnątrztętniczej. Biopsje skóry wykazały pozanaczyniowe lub wewnątrznaczyniowe ciała obce z towarzyszącymi naciekami zapalnymi. Cechy tych ciał obcych były typowe dla cząstek skrobi. Ostatnio Hornez i wsp. opisali rzadki przypadek martwicy żołędzi prącia po wstrzyknięciu podskórnym buprenorfiny i wykazali, że niedokrwienie przypominało oparzenie chemiczne z różnymi poziomami zmian i było również związane ze skrobią. Potier i wsp. zidentyfikowali dwa główne mechanizmy zaangażowane w powstanie martwiczej LLD: embolizację cząsteczek skrobi i owrzodzenia związane z przewlekłym dermohypodermicznym zapaleniem. Schneider i wsp. stwierdzili również, że livedoidalne i martwicze zmiany skórne były prawdopodobnie spowodowane zakrzepicą wywołaną przez substancje pomocnicze oraz że miejscowe zapalenie śródbłonka przyczyniło się do powstania zmian. Wyniki te są zgodne z biopsją skóry pacjenta przedstawionego na rycinie 1: dermatolodzy zidentyfikowali zmianę martwiczą, a biopsja ujawnia zakrzepicę, zapalenie okołonaczyniowe, nieorganiczne cząstki refringentów i cząstki zawierające krzemionkę. Główna hipoteza jest taka, że może to być związane z mechanizmem naczyniowym. W tym fizjopatologicznym kontekście ukierunkowaliśmy nasze badania na wykrywanie cząstek potencjalnie obecnych w roztworach, które użytkownicy narkotyków mogą sobie wstrzykiwać. Ponieważ standardowe podręczniki anatomii i fizjologii podają, że minimalne światło kapilary ma średnicę od 4 do 8 µm, granica 4,2 µm została wybrana tak, aby wyróżnić tylko te cząstki, które są w stanie zablokować ludzkie mikrokapilary. Ponadto, granica ta jest zgodna z Farmakopeą Europejską dotyczącą preparatów do wstrzykiwania. Wykrycie tych cząstek w różnych testowanych roztworach nie jest łatwe. Mimo że różne farmakopee (Europejska, Amerykańska…) dokładnie opisują, jakie kontrole należy przeprowadzać w odniesieniu do substancji czynnych i niektórych substancji pomocniczych, te zalecane techniki nie mogą być stosowane w kontekście naszego badania. W roztworach wodnych badania granulometryczne wymagają znacznego rozcieńczenia; w tej pracy roztwory musiały być rozcieńczone do końcowej objętości 125 mL. Obowiązek ten powoduje zmniejszenie czułości, co wyjaśnia brak wyników dla stanu SFS (ryc. 3A). Z tego powodu przekierowaliśmy cytometrię przepływową z jej zwykłego zastosowania, w celu zbadania liczby cząstek i ich zakresu wielkości. Połączenie tych dwóch podejść pozwoliło nam zrozumieć dystrybucję nierozpuszczalnych cząstek. Całkowita liczba cząstek jest systematycznie wyższa w przypadku roztworu ogólnego (ryc. 3B) z większością cząstek o wielkości <10 µm dla roztworu ogólnego i >10 µm dla roztworów Subutex, niezależnie od wielkości i rodzaju filtracji. Wyniki te są zgodne z pracą Roux et al., która oceniała skuteczność Sterifilt . Drugim etapem tej pracy było określenie charakteru cząstek w roztworze. Chociaż spektroskopia w podczerwieni i skaningowa mikroskopia elektronowa są technikami referencyjnymi, natura roztworów uniemożliwia wykorzystanie wyników. Główna przeszkoda wynika z dużej ilości skrobi kukurydzianej obecnej w obu lekach. W roztworze wodnym substancja ta przekształca się w nieprzezroczysty i lepki roztwór koloidalny, zwany opatrunkiem skrobiowym, który po wyschnięciu krystalizuje się i przykrywa pozostałe cząsteczki, co utrudnia lub wręcz uniemożliwia interpretację analiz. W celu wyeliminowania skrobi kukurydzianej roztwory były rozcieńczane przed filtracją na membranie 0,22 µm, co umożliwiało zatrzymanie wyłącznie cząstek nierozpuszczalnych. W tych warunkach analitycznych różnica w wyglądzie nierozpuszczalnych cząstek zatrzymanych na membranie filtracyjnej jest oczywista. Ogólna wielkość cząstek i niejednorodny kształt kontrastują z jednorodnością cząstek Subutex. Cecha ta jest obecna zarówno przed, jak i po filtracji bawełnianej (rys. 4). Różnica ta jest jeszcze silniejsza, gdy przyjrzymy się widoczności porów membrany filtrującej: są one prawie całkowicie zablokowane przez nierozpuszczalne cząstki obecne w roztworach CFG, podczas gdy są one widoczne w przypadku roztworów CFS (rysunek 4E versus 4J, kółko z linią przerywaną). Wyniki te potwierdzają dane uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej i granulometrii laserowej: w warunkach CFG występuje większy odsetek cząstek o rozmiarze mniejszym niż 4,2 µm niż w warunkach CFS. Niejednorodność tych cząstek jest również widoczna na obrazach SEM powierzchni przekroju tabletki nie naruszonej, to znaczy przed jakimkolwiek „niewłaściwym użyciem”. Dane SEM uzyskane po filtracji Sterifilt nie są wyświetlane, ponieważ nie można ich wykorzystać, biorąc pod uwagę, jak niezwykle rzadkie są widoczne cząstki na powierzchni membrany filtracyjnej. Dlatego, po rozcieńczeniu tabletki buprenorfiny, tylko Sterifilt wydaje się być zdolny do zatrzymania całości nierozpuszczalnych cząstek, nawet gdy ich rozmiar jest mniejszy niż rozmiar sita filtracyjnego. Obecność cząstek o ekstremalnych rozmiarach nie jest stwierdzona w SEM, podczas gdy granulometria laserowa i cytometria przepływowa wskazują na cząstki, których rozmiar jest większy niż 10 µm. Rozbieżność ta jest prawdopodobnie związana z systemami detekcji, które wykorzystują dyfrakcję światła (granulometria laserowa i cytometria przepływowa). Techniki te nie są w stanie odróżnić agregatu małych cząstek od pojedynczej cząstki. Rzeczywiście, obecność dużych cząstek w warunkach filtracji bawełnianej jest prawdopodobnie spowodowana tym ograniczeniem. Jednakże, czy powinniśmy uważać tę agregację za artefaktową czy „fizjologiczną”? Kilka argumentów wydaje się wzmacniać rzeczywistość tych agregatów.
Po pierwsze, nierozpuszczalne substancje pomocnicze stosowane w generyku są cząsteczkami, które posiadają wiele grup apolarnych na swojej powierzchni. W roztworze wodnym, gdy stykają się powierzchnie 2 cząstek, oddzielająca je woda jest wyrzucana, co ułatwia agregację cząstek. Ta właściwość fizyko-chemiczna pozwala nam wyjaśnić, dlaczego cząstki, których rozmiar jest mniejszy niż 10 µm, są zatrzymywane przez Sterifilt, ponieważ główna część porów membrany filtracyjnej jest wolna (co potwierdzają roztwory SFG). Po filtracji bawełnianej, agregaty nie są zatrzymywane i przechodzą: są widoczne na membranie filtracyjnej (Rysunek 4). Kółka przerywanej linii na rysunku 4 pokazują zablokowane pory membrany filtracyjnej dla CFG (rysunek 4J), podczas gdy dla stanu CFS są one wolne (rysunek 4E). Drugi argument potwierdzający realność tych agregatów dotyczy projektu eksperymentu stosowanego w cytometrii przepływowej. Próbki analizowane tą techniką są najbardziej zbliżone do rzeczywistości: analiza próbki CF wymagała jedynie bardzo małego dodatkowego rozcieńczenia. Jest więc bardzo prawdopodobne, że największe cząstki wyróżnione przez cytometrię przepływową odpowiadają w rzeczywistości cząstkom zagregowanym. Ostatni etap pracy to analiza charakteru nierozpuszczalnych cząstek, które nie zostały zatrzymane na filtrze bawełnianym. Spodziewaliśmy się wyodrębnienia następujących pierwiastków chemicznych: magnezu dla Subutexu, krzemionki i magnezu dla generyku. Analiza spektralna nie wykazała obecności magnezu w nierozpuszczalnych cząstkach widocznych w warunkach CFG i CFS. Wynik ten jest prawdopodobnie związany z niewielką ilością magnezu obecną w obu rodzajach tabletek, w połączeniu z niewystarczającą czułością techniki, która nie pozwala na przedstawienie pierwiastków, których liczebność wynosi <0,5%. Jednak obecność krzemionki wydaje się być wszechobecna w przypadku stanu CFG: całość analizowanych cząstek zawiera krzemionkę, w tym fragmenty powodujące zablokowanie błony filtracyjnej. Źródłem tej krzemionki może być koloidalna bezwodna krzemionka, taka jak talk, obecna w generyku. W stosowanych warunkach analitycznych pochodzenie cząstek zawierających krzemionkę jest niemożliwe do ustalenia.
Wyniki te pozostają jednak zaskakujące, prowadząc do pytań o naturę pozornie nierozpuszczalnych substancji pomocniczych. W przeciwieństwie do substancji czynnych, nie istnieje specyficzny przemysł farmaceutyczny zajmujący się substancjami pomocniczymi: w większości przypadków jest to jedynie przeniesienie z zastosowania np. spożywczego lub kosmetycznego do zastosowania farmaceutycznego. Patricia Rafidison, reprezentująca International Pharmaceutical Excipients Council, która była gościem Narodowej Akademii Farmacji w czasie sesji tematycznej poświęconej surowcom farmaceutycznym, wyznała, że trudno jest ustalić, skąd pochodzą substancje pomocnicze, ponieważ czasami sami dostawcy nie wiedzieli, jakie zastosowanie farmaceutyczne może mieć ich produkt .
Podsumowując, wykazaliśmy, że procedura iniekcji stosowana przez użytkowników leków iniekcyjnych umożliwia ekstrakcję około 90% buprenorfiny zawartej w dostępnych na rynku tabletkach podjęzykowych. Różnice w formulacjach galenowych pomiędzy Subutexem a jego generykami występują również w roztworach, które użytkownicy mogliby samodzielnie wstrzykiwać. Po zastosowaniu płatka kosmetycznego, nierozpuszczalnych cząstek jest znacznie więcej, a ich średnia wielkość jest gorsza w roztworze buprenorfiny generycznej niż w roztworze Subutex. Po przesączeniu przez bawełnę można również zaobserwować ważną populację cząstek, których wielkość jest mniejsza niż 1 µm w roztworach generycznej buprenorfiny, ale nie w roztworach Subutex (rysunek 4E i 4J). Wszystkie nierozpuszczalne cząstki znalezione w generycznych roztworach buprenorfiny po filtracji bawełnianej zawierają krzemionkę, podczas gdy w nierozpuszczalnych cząstkach Subutexu nie zidentyfikowano żadnego elementu mineralnego.
Ponieważ biopsja skóry była pierwotnie przeznaczona do diagnostyki patologicznej, precyzyjna identyfikacja chemiczna cząstek zawierających krzemionkę pozostaje niemożliwa. Niemniej jednak cząsteczki zidentyfikowane w roztworach CFG (rysunek 5D) i bardzo gęste cząsteczki zawierające krzemionkę zidentyfikowane w biopsji skóry (rysunek 1D) mogą być takie same. Dokładna identyfikacja chemiczna i strukturalna cząstek in situ powinna umożliwić potwierdzenie tego związku.