Practice for Human Genetics Vienna

Genome-wide search for microaberrations: Array-CGH

Złożone zespoły chorobowe, których podłożem jest zwielokrotnienie lub redukcja materiału chromosomalnego, znane są od dawna. W trisomii 21, na przykład, kompletny chromosom jest obecny trzy razy zamiast dwa razy. W zespołach mikrodelecji, takich jak zespół Williamsa-Beurena, Pradera-Williego czy Smitha-Magenisa, brakuje mniej lub bardziej określonych odcinków chromosomów, zwykle w skali submikroskopowej, rzędu kilku megabaz. W przypadku chorób monogenetycznych, delecje lub duplikacje poszczególnych genów lub segmentów genów są ostatnio coraz częściej odkrywane jako przyczyna choroby.

Dotychczasowe techniki stosowane w diagnostyce takich zmian dawkowania genów mają swoje ograniczenia: Na przykład, chociaż molekularne metody cytogenetyczne, takie jak FISH lub molekularne metody genetyczne, takie jak MLPA, mogą być stosowane z wysoką lub najwyższą rozdzielczością, muszą one wiedzieć lub zakładać a priori, który obszar genomu jest dotknięty. Z drugiej strony, cytogenetyka klasyczna lub technika CGH („porównawcza hybrydyzacja genomowa”: Hybrydyzacja porównawcza DNA pacjenta i DNA referencyjnego na chromosomach metafazowych) może objąć cały genom, ale rozdzielczość jest ograniczona do około 5 Mb w najlepszym przypadku ze względu na użycie mikroskopu świetlnego.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia istniejących technik, tablicowa CGH jest odpowiednią alternatywą.

Tutaj konwencjonalna technika CGH jest połączona z doświadczeniem zdobytym w analizie ekspresji przy użyciu mikromacierzy: Określone fragmenty DNA unieruchomione na powierzchni szkiełka służą jako cele hybrydyzacji, przy czym termin „matryca” odnosi się do regularnego, przypominającego siatkę układu tych fragmentów. Fragmenty są tak dobrane, aby pokryć ludzki genom tak równomiernie, jak to możliwe.

Do analizy, w przybliżeniu równe ilości DNA pacjenta i referencyjnego genomowego DNA są kohybrydyzowane na tablicy. Ponieważ próbki DNA pacjenta i próbki referencyjne są znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi, zmiana liczbowa w genomie pacjenta prowadzi do przesunięcia koloru w sygnale fluorescencyjnym poszczególnych fragmentów poprzez przesunięcie w stosunku hybrydyzacji.

Schematyczne przedstawienie techniki tablicowej CGH:

w skanerze wykrywa sygnały fluorescencyjne i rejestruje przesunięcia kolorów. Za pomocą odpowiedniego oprogramowania sygnały są przypisywane do regionu genu, a wynik może być wyświetlany np. jako „kariogram”, pokazujący, w którym miejscu chromosomu występują zmiany.

Pokazanie wyniku tablicy CGH: duplikacja regionu Xp11-p21.1 (utworzona w ZMG za pomocą CGHAnalytics, Agilent)

Liczba i gęstość fragmentów na tablicy określają rozdzielczość tablicy CGH. Obecnie dostępne są tablice obejmujące cały ludzki genom o rozdzielczości od 1 Mb do około 35 kb. Ze względu na stale rosnącą liczbę fragmentów na matrycę, rozdzielczość będzie nadal wzrastać. W ten sposób nierównowaga poszczególnych genów może być wiarygodnie wykryta.

Zastosowania tablicy CGH

Macierz CGH jest więc techniką, w której kompletny genom pacjenta może być badany z wysoką rozdzielczością pod kątem odchyleń od normalnego dawkowania genów. Zyskuje ona coraz większe znaczenie jako innowacyjna metoda przesiewowa, choć początkowo była wykorzystywana głównie w diagnostyce nowotworów. Dzieje się tak, ponieważ progresja nowotworu charakteryzuje się nagromadzeniem aberracji, którym może towarzyszyć amplifikacja onkogenów i delecja genów supresorowych.

ArrayCGH jest szczególnie interesujący w diagnostyce przypadków niewyjaśnionego upośledzenia umysłowego. W standardowej cytogenetyce aberracje są widoczne w około 5% przypadków u pacjentów z upośledzeniem umysłowym i dodatkowymi objawami dysmorfii lub rodzinnego skupiska. Badania subtelomerów metodą FISH lub MLPA mogą znaleźć przyczynę w kolejnych 5% przypadków. Ostatnie badania pokazują, że macierz CGH o rozdzielczości około 1 Mb ujawnia nierównowagę genomową u 10-15 % pacjentów z niepozornym kariotypem i negatywnymi wynikami badań subtelomerów. (patrz literatura). Zakłada się, że ten współczynnik wykrywalności będzie wzrastał wraz ze wzrostem rozdzielczości matryc. Niektóre grupy badawcze rekomendują już array CH jako pierwszy krok diagnostyczny w przypadkach niewyjaśnionego upośledzenia umysłowego.

Jednakże array CH nie tylko wykrywa nowe zaburzenia równowagi, ale może być również użyty do precyzyjnego określenia wielkości delecji, lokalizacji punktów przerwania lub pochodzenia dodatkowego materiału w przypadkach cytogenetycznie widocznej utraty lub wzmocnienia regionów chromosomalnych. Jest to ważne dla dokładnej korelacji genotyp-fenotyp oraz dla identyfikacji genów kandydujących zaangażowanych w rozwój MR i dysmorfii. W niektórych nieprawidłowościach chromosomalnych, które wcześniej uznawano za „zrównoważone” translokacje, macierz CGH pozwoliła wykazać, że materiał genetyczny jest usunięty lub zduplikowany w rejonie punktów przerwania, co oznacza, że mamy do czynienia z niezrównoważoną translokacją. Tak więc, z pomocą tablicy CGH, wyniki cytogenetyczne są bardziej precyzyjne i poprawione.

Więc, podczas gdy granice pomiędzy cytogenetyką i genetyką molekularną stają się coraz bardziej zatarte, kariotypowanie pozostaje ważne, ponieważ niektóre zmiany chromosomalne nie są wykrywalne za pomocą tablicy CGH: Poliploidie, prawdziwie zrównoważone translokacje i stany mozaikowe z niewielkim odsetkiem komórek aberracyjnych.

Z uwagi na wysoki wskaźnik wykrywalności w całym genomie oraz fakt, że nie jest konieczna czaso- i pracochłonna hodowla komórek, macierz CGH otwiera nowe możliwości dla diagnostyki prenatalnej.

Ale przy wszystkich zaletach i możliwościach tej pionierskiej techniki nie należy zapominać, że przeskok od badań do diagnostyki dopiero się dokonuje. Tak więc, array CGH nie tylko wyjaśnia otwarte pytania, interpretacja wyników może również rodzić nowe pytania:

Dzięki badaniom array CGH odkryto, że ludzki genom zawiera niespodziewanie wysoki odsetek regionów, których liczba kopii różni się u fenotypowo normalnych ludzi (patrz literatura). Wielkość tych CNV („copy number variations”) waha się od kilku kilobaz do kilku megabaz. Szacuje się, że każdy osobnik jest nosicielem co najmniej 3-11 takich wariantów. Bazy danych zawierające takie polimorfizmy (czyli mutacje, które w sposób oczywisty nie wpływają na fenotyp) są dopiero tworzone i dlatego są jeszcze niekompletne. Jeśli aberracje są obecnie znalezione w DNA pacjenta za pomocą tablicy CGH, często można spekulować, czy są one w ogóle odpowiedzialne za fenotyp. W większości przypadków konieczne jest również zbadanie DNA rodziców.

Prawdopodobieństwo, że aberracja chromosomalna jest chorobotwórcza wzrasta

• z wielkością aberracji
• jeśli jest ona obecna „de novo”, rodzice nie są nosicielami tej aberracji
• jeśli nie jest ona wymieniona w żadnej bazie danych polimorfizmów
• jeśli dotknięte są geny, które mogą być powiązane z obserwowanym fenotypem
• jeśli znane są przypadki z tą samą lub podobną aberracją, które wykazują podobny fenotyp.

Im więcej tablic CGH będzie wykorzystywanych w diagnostyce klinicznej, tym bardziej prawdopodobne jest, że projekt tablicy dostosuje się do wymagań tej dziedziny: Unikając znanych regionów CNV i faworyzując regiony chromosomalne i geny zaangażowane w opóźnienie umysłowe i zespoły dysmorficzne, tablice staną się coraz bardziej interesujące dla diagnostyki pre- i postnatalnej.

Nasz instytut wyznaczył kurs, aby skorzystać z technologii tablic już teraz i być w stanie natychmiast odebrać przyszłe osiągnięcia. Postawiliśmy na sprzęt techniczny, który może również niezawodnie i powtarzalnie oceniać tablice o najwyższej rozdzielczości.

Skontaktuj się z nami, jeśli chciałbyś skorzystać z naszych usług i doświadczenia w dziedzinie tablic CGH. Chętnie poinformujemy Państwa o czasie trwania takiego badania, kosztach i projektach tablic, które mogą być obecnie stosowane.

References

Array CGH in mental retardation

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Porównawcza hybrydyzacja genomowa oparta na mikromacierzy (array-CGH) wykrywa submikroskopowe delecje i duplikacje chromosomalne u pacjentów z zaburzeniami uczenia się/opóźnieniem umysłowym i cechami dysmorficznymi. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Diagnostyczne profilowanie genomu w upośledzeniu umysłowym. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Emerging patterns of cryptic chromosomal imbalances in patients with idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of the literature. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenatal detection of unbalanced chromosomal rearrangements by array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Comparative genomic hybridization and prenatal diagnosis. Curr Opin Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97

.