Niespodziewane odkrycie nowego szlaku zarządzanego przez białko sygnalizacyjne Notch otwiera drzwi dla lepszego rozwoju leków
By Lindsay Brownell
(BOSTON) – W każdej minucie półtora galona krwi przepływa przez sieć żył i tętnic w organizmie. Siła tego przepływu krwi pomaga utrzymać w zdrowiu komórki wyściełające naczynia krwionośne, zwane komórkami śródbłonka; kiedy przepływ krwi jest zakłócony, np. podczas zabiegów chirurgicznych lub udaru, naczynia zaczynają przeciekać, co może wywołać szereg reakcji zapalnych, które prowadzą do uszkodzenia komórek i chorób. Naukowcy z Instytutu Wyss na Uniwersytecie Harvarda postanowili rozwiązać zagadkę, w jaki sposób przepływ krwi utrzymuje naczynia w stanie nienaruszonym i ku ich zaskoczeniu odkryli zupełnie nową ścieżkę sygnalizacji komórkowej, która jest obiecującym celem dla leków stosowanych w leczeniu różnych wyniszczających warunków.
„Odkryliśmy, że dobrze znane białko Notch jest odpowiedzialne za zapobieganie przeciekaniu naczyń krwionośnych, a czyni to za pomocą wtórnego szlaku sygnalizacyjnego, który działa w zupełnie inny sposób niż jego znany szlak oparty na transkrypcji” – mówi Chris Chen, M.D., Ph.D., członek wydziału stowarzyszonego w Wyss Institute i dyrektor założyciel Biological Design Center oraz Distinguished Professor of Biomedical Engineering na Boston University, który jest autorem pracy. „Ta nowa ścieżka jest nie tylko ekscytująca z punktu widzenia odkrycia, ale może również złagodzić niektóre skutki uboczne leków przeciwnowotworowych i kardiologicznych, czyniąc je bezpieczniejszymi i bardziej skutecznymi”. Badanie zostało opublikowane dzisiaj w Nature.
Komórki śródbłonka, które linie naczyń krwionośnych są połączone ciasno razem przez połączenia zwane adherens junctions, aby utworzyć barierę, która utrzymuje krew wewnątrz naczynia i reguluje, jak łatwo inne substancje mogą przechodzić w i z niego. Aby zbadać tę barierę i ustalić, dlaczego brak przepływu krwi powoduje jej nieszczelność, naukowcy zbudowali model blood-vessel-on-a-chip składający się z kanału wyłożonego warstwą ludzkich komórek śródbłonka otoczonych macierzą pozakomórkową w urządzeniu mikrofluidycznym, co pozwoliło im łatwo symulować i kontrolować przepływ krwi przez naczynie oraz oceniać reakcje komórek.
Komórki śródbłonka, które doświadczyły przepływu krwi, wykazywały zwiększoną aktywność transmembranowego białka Notch1, podczas gdy komórki wystawione na działanie statycznej krwi nie. Kiedy badacze dodali substancję chemiczną, która blokuje aktywację Notch1 poprzez zapobieganie odłączaniu się jego wewnątrzkomórkowej domeny, zaobserwowali, że naczynie zaczęło przeciekać, co określili jako spowodowane zaburzeniem połączeń adherentnych pomiędzy sąsiadującymi komórkami śródbłonka i reorganizacją włókien aktyny w obrębie każdej komórki. Potwierdziło to, że aktywacja Notch1 przez przepływ krwi jest niezbędna do tworzenia i utrzymywania bariery śródbłonkowej naczyń krwionośnych.
Co ciekawe, zapobieganie wewnątrzkomórkowej domenie Notch1 od inicjowania transkrypcji po odłączeniu (co jest dobrze poznanym mechanizmem działania Notch1) nie sprawiło, że naczynia przeciekały, co sugerowało, że jakaś inna część białka, której funkcja nie obejmowała transkrypcji, odpowiadała na przepływ krwi. To podejrzenie zostało wzmocnione przez eksperymenty in vivo, w których naukowcy wstrzyknęli myszom substancję chemiczną blokującą Notch1 wraz z niebieskim barwnikiem i zauważyli, że barwnik wyciekał z naczyń krwionośnych leczonych myszy w znacznie szybszym tempie niż oczekiwano. „Transkrypcja genu na białko, które następnie wykonuje jakąś funkcję w komórce, trwa na ogół około dwóch godzin, ale my obserwowaliśmy wyciek w ciągu 30 minut, co dodatkowo sugeruje, że jakikolwiek proces kontrolujący przepuszczalność bariery działa poprzez zupełnie inny mechanizm” – mówi dr Bill Polacheck, Postdoctoral Fellow w Wyss Institute i współautor pracy.
Po ustaleniu, że domena wewnątrzkomórkowa nie była zaangażowana w regulację bariery śródbłonkowej, naukowcy przeskanowali inne części Notch1 pod kątem aktywności. Użyli CRISPR/Cas-9, aby usunąć różne sekcje genu Notch1 i odkryli, że usunięcie sekcji, która koduje domenę wewnątrzkomórkową, nie miało wpływu na przepuszczalność, podczas gdy usunięcie maleńkiej domeny transmembranowej (TMD) sekcji, jak również spowodowało wzrost przecieku naczyń w warunkach przepływu. „To pierwszy raz, kiedy biologiczna funkcja TMD Notcha została oceniona” – mówi dr Matthew Kutys, Visiting Fellow w Wyss Institute i współautor pracy. „W dużej mierze zakładano, że jest on obojętny i po prostu znika po aktywacji, a większość podręczników i prac badawczych nawet nie pokazuje go jako odrębnej części receptorów Notch”. Dzięki dalszym badaniom zorientowali się, że kiedy Notch1 jest aktywowany i jego domena wewnątrzkomórkowa jest uwalniana, jego TMD składa kompleks w błonie z białkami VE-kadheryny, Rac1, LAR i Trio, które wspólnie składają i utrzymują połączenia adherencyjne między komórkami i rozprowadzają włókna aktyny przeciwko błonie komórkowej, aby wspierać te połączenia.
„Patrząc z perspektywy czasu, rzuciliśmy kostką w tym projekcie, ponieważ decydując się na badanie Notcha, wchodziliśmy w jeden z najbardziej zatłoczonych obszarów badawczych w biologii. Jednak nasze inżynierskie podejście pozwoliło nam zbadać go w nowy sposób, bez wpływu i uprzedzeń wynikających z wcześniejszych prac, co moim zdaniem sprawiło, że byliśmy na tyle otwarci, by zaobserwować i scharakteryzować tę nową, nieoczekiwaną ścieżkę” – mówi Polacheck. „Wiedza, że Notch1 reguluje adhezję komórek oprócz różnicowania komórek, oferuje również nowe ramy dla zrozumienia koordynacji złożonych procesów komórkowych, w tym, że pojedyncze cząsteczki, takie jak Notch, mogą odgrywać wiele ról”, dodaje Kutys.
Objawienie, że Notch1 służy różnym funkcjom, a także wiedza, które części białka rządzą każdą funkcją, pozwala na opracowanie nowych leków, które są zarówno bardziej skuteczne, jak i mniej toksyczne. „Notch jest celem dla niektórych terapii nowotworowych, ale leki te są znane z tego, że powodują obrzęk i inne problemy. Teraz aktywnie pracujemy nad rozdzieleniem dwóch ścieżek Notcha, tak abyśmy mogli stworzyć leki, które celują tylko w domenę wewnątrzkomórkową, oszczędzając TMD, a tym samym zachowując integralność naczyń krwionośnych” – mówi dr Karen Hirschi, profesor medycyny i genetyki w Yale School of Medicine, która współpracowała przy badaniach. Wiedza o tym, że Notch reguluje przepuszczalność naczyń krwionośnych, czyni go kandydatem na nowy lek w leczeniu chorób układu krążenia, a zespół bada również TMD jako potencjalny środek terapeutyczny, ponieważ modele komórkowe, które zostały wystawione na działanie zapalenia wywołującego przecieki, wykazały dramatyczną redukcję przecieków, gdy zostały zmodyfikowane tak, aby wyrażały TMD.
„Współpraca, którą Instytut Wyss umożliwia i pielęgnuje pomiędzy różnymi dziedzinami, takimi jak inżynieria mechaniczna i biologia molekularna, sprzyja nowym podejściom do starych problemów, które mogą prowadzić do prawdziwie zmieniających paradygmat wyników”, mówi Donald Ingber, M.D. Ph.D., dyrektor założyciel Instytutu Wyss i profesor biologii naczyniowej Judah Folkman w Harvard Medical School oraz programu biologii naczyniowej w Boston Children’s Hospital, który jest również profesorem bioinżynierii w Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). „To badanie jest doskonałym przykładem korzyści, jakie tego typu partnerstwa mogą przynieść nauce i społeczeństwu.”
Dodatkowi autorzy badania to Jinling Yang, Ph.D., Postdoctoral Fellow w Wyss Institute; Jeroen Eyckmans, Ph.D., były Wyss Postdoctral Fellow i obecny lider grupy na Uniwersytecie Bostońskim; Yinyu Wu, studentka studiów podyplomowych w Departamencie Genetyki w Yale; i Hema Vasavada, kierownik laboratorium w Yale School of Medicine.
Badania te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (NIH), National Science Foundation (NSF), Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, The Hartwell Foundation i Wyss Institute na Harvard University.
- PUBLIKACJA – Nature: A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function
.