Sekwencjonowanie 16S czy sekwencjonowanie typu shotgun? Prawie wszyscy badacze mikrobiomu zadają sobie to pytanie, kiedy planują nowe badania, ponieważ zdecydowana większość publikacji dotyczących mikrobiomu wykorzystuje sekwencjonowanie genu 16S rRNA lub sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun do generowania surowych danych do późniejszych analiz profilowania mikrobiologicznego lub metagenomiki. Każda metoda ma swoje wady i zalety, więc którą metodę należy wybrać?
Co to jest sekwencjonowanie genu 16S rRNA?
Sekwencjonowanie genu 16S rRNA, lub po prostu sekwencjonowanie 16S, wykorzystuje PCR do namierzania i amplifikacji fragmentów regionów hiperzmiennych (V1-V9) bakteryjnego genu 16S rRNA1. Amplikony z oddzielnych próbek otrzymują następnie molekularne kody kreskowe, są łączone razem i sekwencjonowane. Po sekwencjonowaniu, surowe dane są analizowane za pomocą potoku bioinformatycznego, który obejmuje przycinanie, korekcję błędów i porównanie z referencyjną bazą danych 16S. Po przypisaniu odczytów do rangi filogenetycznej można wygenerować profil taksonomiczny. Podobnie sekwencjonowanie ITS opiera się na tej samej strategii, ale ukierunkowane jest na region ITS (Internal Transcribed Spacer) występujący w genomach grzybów.
Czym jest sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun?
W przeciwieństwie do sekwencjonowania 16S, które ukierunkowane jest tylko na geny 16S rRNA, sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun sekwencjonuje całe genomowe DNA z próbki. Proces przygotowania biblioteki jest podobny do regularnego sekwencjonowania całego genomu, włączając w to losową fragmentację i ligację adapterów. Typowy przepływ pracy dla analizy taksonomicznej danych metagenomicznych shotgun obejmuje przycinanie jakości i porównanie z referencyjną bazą danych zawierającą całe genomy (np. Kraken2 i Centrifuge3) lub wybrane geny markerowe (MetaPhlAn4 i mOTU5) w celu wygenerowania profilu taksonomicznego. Ponieważ sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun obejmuje całą informację genetyczną w próbce, dane mogą być wykorzystane do dodatkowych analiz, np. montażu metagenomicznego i binningu, profilowania funkcji metabolicznych i profilowania genów oporności na antybiotyki.
Sekwencjonowanie 16S/ITS vs. Jeśli badania wymagają analiz genomowych wykraczających poza profilowanie taksonomii, takich jak analiza szlaków metabolicznych, należy rozważyć sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun ze względu na większe pokrycie genomiczne i większą ilość danych wyjściowych. Jeśli głównym celem badania jest profilowanie składu, obie techniki mają zalety i wady, które należy rozważyć (Tabela 1).
16S/ITS Sequencing
Shotgun Sequencing
Shallow Shotgun Sequencing
.
Bacteria/Fungi Coverage
High
Limited
Limited
Cross-Domain Coverage
No
Yes
Tak
False Positives
Low Risk
High Risk
Wysokie Ryzyko
High Risk
Taxonomy Resolution
Genus-Species
Species-Strains
Species-Strains
Host DNA Interference
No
Yes
Yes
Minimum Wkład DNA
10 kopii 16S
1 ng
1 ng
Profilowanie funkcjonalne
Nie
Nie
Tak
Tak
Zalecany typ próbki
Wszystko
Mikrobiom człowieka
Mikrobiom człowieka Feces
Cost per Sample
~ $80
~ $200
~ $120
Table 1: Ogólnie rzecz biorąc, sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun ma większą rozdzielczość taksonomiczną, profilowanie funkcjonalne i pokrycie między domenami. We wszystkich innych aspektach, łącznie z ceną i zgodnością pochodzenia próbek, sekwencjonowanie 16S/ITS ma przewagę.
Rozdzielczość taksonomiczna
Rozdzielczość taksonomiczna sekwencjonowania 16S/ITS zależy od docelowych regionów zmiennych, samego organizmu i algorytmu analizy sekwencji. W ostatnich latach, niektóre metody korekcji błędów, np. DADA26, radykalnie poprawiły dokładność i rozdzielczość taksonomiczną tej techniki. Dzięki DADA2, rozdzielczość na poziomie gatunku dla wielu organizmów przy użyciu zwykłego sekwencjonowania 16S jest obecnie rzeczywistością. Jednak w teorii metagenomiczne sekwencjonowanie typu shotgun może osiągnąć rozdzielczość na poziomie szczepu, ponieważ może objąć wszystkie warianty genetyczne. Chociaż w praktyce, dokładność rozdzielczości na poziomie szczepu wciąż napotyka na wyzwania techniczne. Mimo to, sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun osiąga wyższą rozdzielczość w porównaniu z sekwencjonowaniem 16S/ITS.
Profilowanie funkcjonalne
Jeśli celem jest analiza funkcji metabolicznych, większość badaczy szybko przeoczy sekwencjonowanie 16S i ITS. Istnieją jednak narzędzia pozwalające na wnioskowanie o funkcji metabolicznej na podstawie danych taksonomicznych, np. Jednak, ogólnie rzecz biorąc, sekwencjonowanie metagenomiczne typu shotgun jest często wykorzystywane, gdy wymagane jest profilowanie funkcjonalne, ze względu na dodatkowe pokrycie genów.
Pokrycie mikrobiologiczne i zalecany typ próbki
Sekwencjonowanie typu shotgun bada całe metagenomowe DNA, podczas gdy sekwencjonowanie 16S tylko genów 16S rRNA, które również cierpi z powodu niepełnego pokrycia primerami. W związku z tym pierwsze z nich ma większe pokrycie między dziedzinami. Dlaczego więc w tabeli 1 sekwencjonowanie 16S/ITS jest lepsze pod względem pokrycia bakterii i grzybów? Wynika to z pokrycia gatunkowego dostępnych referencyjnych baz danych, ponieważ przewidywanie taksonomii w tych metodach sekwencjonowania w dużym stopniu zależy od zastosowanej referencyjnej bazy danych. Obecnie, pokrycie baz danych 16S/ITS jest znacznie lepsze niż baz całogenomowych. Wynika to z faktu, że całe genomy mikrobów związanych z mikrobiomem człowieka są znacznie lepiej zbadane niż genomy mikrobów związanych z innymi środowiskami. Dlatego zaleca się stosowanie metagenomicznego sekwencjonowania typu shotgun dla próbek związanych z ludzkim mikrobiomem, takich jak kał i ślina, jeśli głównym celem jest profilowanie taksonomii.
Co więcej, sekwencjonowanie metagenomiczne ma większą zależność od referencyjnej bazy danych. Na przykład, jeśli bakteria nie ma blisko spokrewnionego przedstawiciela w referencyjnej bazie danych 16S, można ją zidentyfikować na wyższym poziomie filogenetycznym lub jako nieznaną bakterię. Jednak w przypadku metagenomicznego sekwencjonowania typu shotgun, jeśli bakteria nie ma bliskiego krewnego (genomu z tego samego rodzaju) w referencyjnej bazie genomów, prawdopodobnie nie uda się jej zidentyfikować. Na przykład, ZymoBIOMICS Spike-in Control I zawiera dwa mikroby obce dla ludzkiego mikrobiomu (Imtechella halotolerans i Allobacillus halotolerans), których genomy nie były wcześniej dostępne. Jeśli dodamy je do próbki kału i przeprowadzimy sekwencjonowanie metodą shotgun, większość potoków bioinformatycznych całkowicie je pominie, chyba że ręcznie dodamy te dwa genomy do referencyjnej bazy danych. Z drugiej strony, jeśli analizuje się je za pomocą sekwencjonowania 16S, zostaną one zidentyfikowane dzięki obecności ich sekwencji 16S w referencyjnych bazach danych.
False positives
Narzędzia do korekcji błędów, takie jak DADA2, nie tylko poprawiają rozdzielczość taksonomiczną sekwencjonowania 16S/ITS, ale także poprawiają dokładność. Zostało to zademonstrowane podczas sekwencjonowania DNA z mock microbial community (np. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Wszystkie sekwencje 16S są odzyskiwane bez błędów w sekwencji, tzn. nie ma fałszywych pozytywów. Jednak w przypadku metagenomicznego sekwencjonowania typu shotgun, o ile w referencyjnej bazie danych nie ma idealnego reprezentatywnego genomu dla sekwencjonowanego mikroba, analiza bioinformatyczna prawdopodobnie przewiduje istnienie wielu „blisko spokrewnionych” genomów. Te blisko spokrewnione genomy mogą pochodzić od różnych gatunków tego samego rodzaju lub nawet różnych rodzajów. Na przykład, załóżmy, że istnieją trzy blisko spokrewnione mikroby, A, B i C, i mają one pewne wspólne sekwencje. Gatunek A dzieli niektóre sekwencje tylko z B, a inne tylko z C. Jeśli referencyjna baza danych zawiera genomy tylko z B i C, to gdy A został zsekwencjonowany, bioinformatyka przewidzi obecność zarówno B jak i C. Na przykład, zarówno A i B mogą być szczepami Escherichia coli, a C to Salmonella enterica; sekwencje unikalnie dzielone przez B i C mogą pochodzić z horyzontalnego transferu genów, który jest powszechny między blisko spokrewnionymi mikrobami. Z tego powodu sekwencjonowanie 16S/ITS jest lepsze w odniesieniu do wyników fałszywie dodatnich.
Interferencja DNA gospodarza
Obecność zbyt dużej ilości DNA gospodarza może powodować niespecyficzną amplifikację w procesie przygotowania biblioteki sekwencjonowania 16S i ITS, ale wpływ ten można kontrolować przez dostosowanie cykli PCR i zmianę primerów. Z drugiej strony, interferencja DNA gospodarza jest znacznie trudniejszym problemem dla sekwencjonowania metagenomicznego typu shotgun, mimo że koszt sekwencjonowania drastycznie się zmniejszył. W zależności od rodzaju próbki, niektóre próbki mogą zawierać >99% ludzkiego DNA gospodarza, co nie tylko zwiększa koszt sekwencjonowania, ale także wprowadza niepewność do pomiaru. Z tego powodu wielu badaczy przed przygotowaniem biblioteki do sekwencjonowania typu shotgun rozważa zubożenie DNA gospodarza, np. za pomocą zestawu HostZERO Microbial DNA Kit. Jednakże, może nie pozostać wystarczająca ilość mikrobiologicznego genomowego DNA do sekwencjonowania shotgun po zubożeniu DNA gospodarza, które zazwyczaj wymaga minimalnego wkładu 1ng. Interferencja DNA gospodarza jest powodem, dla którego płytkie sekwencjonowanie shotgun jest zalecane tylko dla próbek ludzkiego kału.
Wkład DNA
Choć sekwencjonowanie metagenomiczne Shotgun wymaga minimalnego wkładu 1 ng DNA, sekwencjonowanie 16S/ITS jest o wiele bardziej czułe, z minimami wkładu na poziomie femtogramów lub nawet tak niskim jak 10 kopii genów 16S rRNA.
Here to Help
Wybór pomiędzy sekwencjonowaniem 16S a metagenomicznym sekwencjonowaniem typu shotgun jest krytycznym krokiem dla wszystkich badań mikrobiomu. Oprócz budżetu należy rozważyć wiele aspektów projektu, w tym typ próbki, pożądane analizy, rozdzielczość taksonomiczną i organizmy docelowe. Uwzględnienie tych czynników pomoże wybrać właściwą metodę sekwencjonowania dla kolejnego projektu mikrobiomowego. Usługi sekwencjonowania mikrobiomu firmy ZymoBIOMICS oferują sekwencjonowanie 16S, ITS i sekwencjonowanie typu shotgun jako kompletne usługi od ekstrakcji DNA poprzez sekwencjonowanie i bioinformatykę. Eksperci ds. sekwencjonowania i bioinformatyki w firmie Zymo Research chętnie pomogą Ci wybrać odpowiednią metodę sekwencjonowania do Twojego badania.
Dowiedz się, która metoda sekwencjonowania jest dla Ciebie najlepsza. Porozmawiaj z ekspertami świadczącymi usługi sekwencjonowania ZymoBIOMICS.
Learn More
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Methodological Challenges and Opportunities. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333. 2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology 2014 15(3): R46. 3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: rapid and sensitive classification of metagenomic sequences. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729. 4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods 2012 9(8): 811-814. 5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199. 6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: High resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods 2016 13(7): 581-583. 7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
