Sekwencjonowanie genomu wirusa grypy i charakterystyka genetyczna

Sekwencjonowanie genomu

Wirusy grypy stale się zmieniają, w rzeczywistości wszystkie wirusy grypy podlegają zmianom genetycznym w czasie (więcej informacji na ten temat można znaleźć w części Jak wirus grypy może się zmieniać: „Dryf” i „Shift”). Genom wirusa grypy składa się ze wszystkich genów, które tworzą wirusa. CDC prowadzi całoroczny nadzór nad krążącymi wirusami grypy w celu monitorowania zmian w genomie (lub częściach genomu) tych wirusów. Praca ta jest wykonywana w ramach rutynowego nadzoru nad grypą w USA oraz w ramach roli CDC jako ośrodka współpracującego ze Światową Organizacją Zdrowia (WHO) w zakresie referencyjności i badań nad grypą. Informacje zbierane przez CDC w wyniku badania zmian genetycznych (znanych również jako „substytucje”, „warianty” lub „mutacje”) w wirusach grypy odgrywają ważną rolę dla zdrowia publicznego, pomagając określić, czy szczepionki i leki przeciwwirusowe będą działać przeciwko obecnie krążącym wirusom grypy, jak również pomagając określić potencjał wirusów grypy u zwierząt do zarażania ludzi.

Sekwencjonowanie genomu ujawnia sekwencję nukleotydów w genie, jak litery alfabetu w słowach. Nukleotydy są cząsteczkami organicznymi, które tworzą strukturalną jednostkę budującą kwasy nukleinowe, takie jak RNA lub DNA. Wszystkie wirusy grypy składają się z jednoniciowego RNA, w przeciwieństwie do dwuniciowego DNA. Geny RNA wirusów grypy składają się z łańcuchów nukleotydów połączonych ze sobą i kodowanych literami A, C, G i U, które oznaczają odpowiednio adeninę, cytozynę, guaninę i uracyl. Porównanie składu nukleotydów w jednym genie wirusa z kolejnością nukleotydów w innym genie wirusa może ujawnić różnice między tymi dwoma wirusami.

Zmiany genetyczne są ważne, ponieważ mogą wpływać na strukturę białek powierzchniowych wirusa grypy. Białka zbudowane są z sekwencji aminokwasów.

Zastąpienie jednego aminokwasu innym może wpłynąć na właściwości wirusa, takie jak zdolność przenoszenia się wirusa między ludźmi oraz podatność wirusa na leki przeciwwirusowe lub obecne szczepionki.

Wirusy grypy A i B – podstawowe wirusy grypy zakażające ludzi – są wirusami RNA posiadającymi osiem segmentów genów. Geny te zawierają „instrukcje” tworzenia nowych wirusów i to właśnie tych instrukcji używa wirus grypy po zainfekowaniu ludzkiej komórki, aby oszukać komórkę w celu wyprodukowania większej liczby wirusów grypy, rozprzestrzeniając w ten sposób infekcję.

Geny grypy składają się z sekwencji cząsteczek zwanych nukleotydami, które łączą się ze sobą w kształt przypominający łańcuch. Nukleotydy są oznaczane literami A, C, G i U.

Sekwencjonowanie genomu jest procesem, który określa kolejność lub sekwencję nukleotydów (tj. A, C, G i U) w każdym z genów obecnych w genomie wirusa. Pełne sekwencjonowanie genomu może ujawnić około 13 500-literową sekwencję wszystkich genów genomu wirusa.

Co roku CDC wykonuje sekwencjonowanie całego genomu na około 7 000 wirusów grypy pochodzących z oryginalnych próbek klinicznych zebranych w ramach nadzoru wirusologicznego. Genom wirusa grypy typu A lub B zawiera osiem segmentów genów, które kodują (tj. określają strukturę i cechy) 12 białek wirusa, w tym jego dwa podstawowe białka powierzchniowe: hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA). Białka powierzchniowe wirusa grypy określają ważne właściwości wirusa, w tym sposób, w jaki wirus reaguje na niektóre leki przeciwwirusowe, podobieństwo genetyczne wirusa do obecnych wirusów szczepionki przeciwko grypie oraz potencjał wirusów grypy odzwierzęcej (pochodzenia zwierzęcego) do zakażania żywicieli ludzkich.

Charakterystyka genetyczna

CDC i inne laboratoria zdrowia publicznego na całym świecie sekwencjonują geny wirusów grypy od lat 80-tych. CDC przekazuje sekwencje genów do publicznych baz danych, takich jak GenBankexternal icon i Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data (GISAID)external icon, do użytku naukowców zajmujących się zdrowiem publicznym. Powstałe w ten sposób biblioteki sekwencji genów pozwalają CDC i innym laboratoriom na porównanie genów obecnie krążących wirusów grypy z genami starszych wirusów grypy i wirusów stosowanych w szczepionkach. Ten proces porównywania sekwencji genetycznych nazywany jest charakterystyką genetyczną. CDC wykorzystuje charakterystykę genetyczną z następujących powodów:

• Do określenia, jak blisko „spokrewnione” lub podobne są do siebie genetycznie wirusy grypy
• Do monitorowania, w jaki sposób wirusy grypy ewoluują
• Do identyfikacji zmian genetycznych, które wpływają na właściwości wirusa. Na przykład, w celu zidentyfikowania konkretnych zmian, które są związane z wirusami grypy łatwiej się rozprzestrzeniającymi, powodującymi cięższe choroby lub rozwijającymi odporność na leki przeciwwirusowe
• Do oceny, jak dobrze szczepionka przeciw grypie może chronić przed konkretnym wirusem grypy na podstawie jej podobieństwa genetycznego do tego wirusa
• Do monitorowania zmian genetycznych w wirusach grypy krążących w populacjach zwierząt, które mogłyby umożliwić im zakażanie ludzi.

Względne różnice pomiędzy grupą wirusów grypy są przedstawiane poprzez zorganizowanie ich w graficzną formę zwaną „drzewem filogenetycznym”. Drzewa filogenetyczne dla wirusów grypy są jak drzewa rodzinne (genealogiczne) dla ludzi. Drzewa te pokazują, jak blisko „spokrewnione” są ze sobą poszczególne wirusy. Wirusy są grupowane na podstawie tego, czy nukleotydy ich genów są identyczne, czy nie. Drzewa filogenetyczne wirusów grypy zwykle pokazują, jak podobne są do siebie geny hemaglutyniny (HA) lub neuraminidazy (NA) wirusów. Każda sekwencja z konkretnego wirusa grypy ma swoją własną gałąź na drzewie. Stopień różnicy genetycznej (liczba różnic nukleotydów) pomiędzy wirusami jest reprezentowany przez długość poziomych linii (gałęzi) na drzewie filogenetycznym. Im dalej od siebie znajdują się wirusy na osi poziomej drzewa filogenetycznego, tym bardziej różnią się one od siebie genetycznie.

Na przykład, po sekwencjonowaniu przez CDC wirusa grypy A(H3N2) zebranego w ramach nadzoru, sekwencja wirusa jest katalogowana z innymi sekwencjami wirusa, które mają podobny gen HA (H3) i podobny gen NA (N2). W ramach tego procesu, CDC porównuje nową sekwencję wirusa z innymi sekwencjami wirusa i szuka różnic między nimi. Następnie CDC wykorzystuje drzewo filogenetyczne do wizualnego przedstawienia, jak bardzo genetycznie różne są od siebie wirusy A(H3N2).

CDC przeprowadza charakterystykę genetyczną wirusów grypy przez cały rok. Te dane genetyczne są wykorzystywane w połączeniu z danymi dotyczącymi charakterystyki antygenowej wirusa, aby pomóc w ustaleniu, które wirusy szczepionkowe powinny zostać wybrane do nadchodzących szczepionek przeciwko grypie na półkuli północnej lub południowej. W miesiącach poprzedzających spotkania konsultacyjne WHO w sprawie szczepionek, które odbywają się w lutym i wrześniu, CDC zbiera wirusy grypy w ramach nadzoru i porównuje sekwencje genów HA i NA obecnych wirusów szczepionkowych z sekwencjami krążących wirusów grypy. Jest to jeden ze sposobów oceny, jak blisko krążące wirusy grypy są spokrewnione z wirusami, przed którymi szczepionka przeciwko grypie sezonowej została opracowana. Ponieważ wirusy są zbierane i charakteryzowane genetycznie, różnice mogą zostać ujawnione.

Na przykład, czasami w ciągu sezonu, krążące wirusy zmienią się genetycznie, co spowoduje, że staną się inne niż odpowiadający im wirus szczepionkowy. Jest to jedna ze wskazówek, że do szczepionki na następny sezon grypowy może być wybrany inny wirus szczepionkowy, chociaż inne czynniki, w tym wyniki charakterystyki antygenowej, mają duży wpływ na decyzje dotyczące szczepionki. Białka powierzchniowe HA i NA wirusów grypy są antygenami, co oznacza, że są rozpoznawane przez układ odpornościowy i są w stanie wywołać odpowiedź immunologiczną, w tym produkcję przeciwciał, które mogą zablokować infekcję. Charakterystyka antygenowa odnosi się do analizy reakcji wirusa z przeciwciałami, aby pomóc ocenić, w jaki sposób jest on powiązany z innym wirusem.

Metody sekwencjonowania genomu grypy

Tradycyjnie, naukowcy używają techniki sekwencjonowania zwanej „reakcją Sangera” do monitorowania ewolucji grypy jako części nadzoru wirusologicznego. Sekwencjonowanie Sangera identyfikuje dominującą sekwencję genetyczną wśród wielu wirusów grypy znajdujących się w izolacie. Oznacza to, że małe różnice w populacji wirusów obecnych w próbce nie są odzwierciedlone w końcowym wyniku. Naukowcy często wykorzystują metodę Sangera do sekwencjonowania części genomu wirusów grypy, podczas gdy nowsze technologie (patrz następny paragraf) lepiej nadają się do sekwencjonowania całego genomu.

W ciągu ostatnich pięciu lat CDC stosowało metodologie „sekwencjonowania następnej generacji (NGS)”, które znacznie rozszerzyły ilość informacji i szczegółów, jakich może dostarczyć analiza sekwencjonowania. NGS wykorzystuje zaawansowaną detekcję molekularną (AMD) do identyfikacji sekwencji genów każdego wirusa w próbce. Dlatego NGS ujawnia genetyczne różnice pomiędzy wieloma różnymi cząsteczkami wirusa grypy w jednej próbce, a metody te ujawniają również cały region kodujący genomu. Ten poziom szczegółowości może bezpośrednio wpłynąć na podejmowanie decyzji w zakresie zdrowia publicznego w istotny sposób, ale dane muszą być starannie interpretowane przez wysoko wykwalifikowanych ekspertów w kontekście innych dostępnych informacji. Zobacz Projekty AMD: Improving Influenza Vaccines, aby uzyskać więcej informacji na temat tego, jak NGS i AMD rewolucjonizują mapowanie genomu grypy w CDC.