Znaczenie utrwalania
Aby móc badać tkanki pod mikroskopem, muszą one zostać zakonserwowane (utrwalone) i pocięte na odcinki wystarczająco cienkie, aby były przezroczyste. Utrwalanie jest krytycznym etapem w przygotowaniu wycinków histologicznych. Jeśli nie jest ona przeprowadzana w optymalnych warunkach lub jeśli utrwalanie jest opóźnione, próbka tkanki może zostać nieodwracalnie uszkodzona. Bez względu na to, jak bardzo staranna jest późniejsza obróbka tkanki, mikrotomia i barwienie, morfologiczne i histochemiczne informacje uzyskane z próbki będą zagrożone.
Szerokim celem utrwalania tkanek jest zachowanie komórek i składników tkanki w „stanie przypominającym życie” lub jak najmniej zmienionym w stosunku do żywej tkanki, oraz wykonanie tego w taki sposób, aby umożliwić przygotowanie cienkich, wybarwionych sekcji. Wybór utrwalacza i protokołu utrwalania może zależeć od planowanych dodatkowych etapów przetwarzania i analiz końcowych. Nie ma idealnego utrwalacza, choć najbardziej zbliżony jest formaldehyd. Dlatego do użytku dostępne są różne utrwalacze, w zależności od rodzaju występującej tkanki i cech, które mają być wykazane.
Typ utrwalania
Utrwalanie tkanek można osiągnąć za pomocą środków chemicznych lub fizycznych.
Metody fizyczne obejmują ogrzewanie, mikrowoskowanie i kriokonserwację (liofilizację).
Utrwalanie chemiczne uzyskuje się zwykle przez zanurzenie próbki w utrwalaczu (utrwalanie zanurzeniowe) lub, w przypadku małych zwierząt lub niektórych całych narządów, takich jak płuca, przez perfuzję układu naczyniowego utrwalaczem (utrwalanie perfuzyjne). Do niektórych specjalistycznych procedur histochemicznych utrwalacze były czasami stosowane w postaci pary. Na przykład paraformaldehyd i tetratlenek osmu mogą być stosowane do utrwalania w postaci pary liofilizowanych tkanek.
- Dowiedz się więcej o Popularnych roztworach utrwalających
Mechanizm utrwalania
Dwa główne mechanizmy utrwalania chemicznego to wiązanie krzyżowe i koagulacja.
Sieciowanie obejmuje tworzenie wiązań kowalencyjnych zarówno w obrębie białek, jak i między nimi, co powoduje usztywnienie tkanki, a tym samym jej odporność na degradację.
Koagulacja jest spowodowana odwodnieniem białek poprzez zastosowanie alkoholi lub acetonu. Odczynniki te usuwają i zastępują wolną wodę w komórkach i tkankach oraz powodują zmiany w strukturze trzeciorzędowej białek poprzez destabilizację wiązań hydrofobowych. Nazywa się to również denaturacją.
Faktory wpływające na utrwalanie
- Temperatura: Ogólnie rzecz biorąc, wzrost temperatury zwiększał szybkość utrwalania, ale również zwiększał szybkość autolizy i dyfuzji elementów komórkowych. Tradycyjnie, 0 do 4 °C było uważane za idealną temperaturę lub utrwalanie próbek. Obecnie utrwalanie przeprowadza się rutynowo w temperaturze pokojowej.
- Wielkość: 1-4 mm grubości
- Stosunek objętości: Co najmniej 15-20 razy większy niż objętość tkanki
- Czas: 24 – 48 godzin
- PH: Powinno być utrzymywane w zakresie fizjologicznym, pomiędzy pH 4-9. pH dla zachowania ultrastruktury powinno być buforowane między 7,2 a 7,4.
Protokoły
- Metody i protokoły odwapniania materiału kostnego
- Standard Protocol for Formalin-Fixed Paraffin Embedded Tissue
Użyteczne linki
- Proces utrwalania i Nature of Fixatives
- Popularne roztwory utrwalające
- Podstawowe wprowadzenie do histologii
- National Society for Histotechnology
- Wprowadzenie do odwapniania
- Praktyczny przewodnik do dobrej praktyki histologicznej