Wykrywanie endotoksyny–od lizatu amebocytów limulusa do rekombinowanego czynnika C

Endotoksyna bakterii Gram ujemnych jest biologicznym pirogenem, który powoduje gorączkę po wprowadzeniu dożylnym. Endotoksyna, znana również jako lipopolisacharyd (LPS), znajduje się w błonie zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych. Podczas sepsy bakterii Gram-ujemnych, endotoksyna stymuluje makrofagi gospodarza do uwalniania cytokin zapalnych. Jednak nadmierny stan zapalny powoduje niewydolność wielonarządową i śmierć. Endotoksyny, które są wszechobecnymi cząsteczkami patogennymi, są zmorą przemysłu farmaceutycznego i służby zdrowia. Dlatego też wczesne i czułe wykrywanie endotoksyn jest kluczowe dla zapobiegania endotoksemii. Lizat amebocytów limulusa (LAL) jest powszechnie stosowany od około 30 lat do wykrywania endotoksyn w celu zapewnienia jakości leków iniekcyjnych i wyrobów medycznych. LAL stanowi kaskadę proteaz serynowych, które są wyzwalane przez śladowe ilości endotoksyny, a kulminacją jest żelowy skrzep na końcu reakcji. Czynnik C, który normalnie występuje jako zymogen, jest primerem tej kaskady krzepnięcia. In vivo, czynnik C jest doskonałym biosensorem, który ostrzega kraba podkowiastego o obecności Gram-ujemnego najeźdźcy. Hemostatyczny punkt końcowy zatrzymuje najeźdźcę, zabijając go i ograniczając dalszą infekcję. Jednakże, jako narzędzie do wykrywania endotoksyn in vitro, różnice w czułości i specyficzności LAL na endotoksynę oraz malejąca podaż podkowców stanowią coraz większe wyzwanie dla przemysłu biotechnologicznego. Wymusiło to opracowanie alternatywnego testu na obecność endotoksyny. Tak więc czynnik C stał się oczywistym, aczkolwiek trudnym celem dla wysiłków w zakresie technologii rekombinacji. Niniejszy rozdział dokumentuje drogę od wydobycia naturalnego lizatu krwi zagrożonego gatunku do monumentalnego wysiłku inżynierii genetycznej w celu wytworzenia rekombinowanego czynnika C (rFC). RFC jest cząsteczką o masie 132 kDa, która została wyprodukowana jako proenzym indukowany obecnością śladowych ilości endotoksyny. rFC stanowi podstawę zestawu „PyroGene”, który jest nowym mikroenzymatycznym testem diagnostycznym do wysokowydajnych badań endotoksyn. Wykorzystując rFC, Lonza Inc. stworzyła „PyroSense”, który służy jako punkt kontrolny w biotechnologicznej linii produkcyjnej. Tak więc, od klonowania do zastosowań komercyjnych, rFC zapoczątkował nową erę w testowaniu endotoksyn dla zapewnienia jakości produktów biomedycznych i dla przemysłu opieki zdrowotnej, oszczędzając przy tym zagrożone kraby podkowiaste.