Práctica para la Genética Humana de Viena

Búsqueda de microaberraciones en todo el genoma: Array-CGH

Los síndromes complejos basados en la multiplicación o reducción del material cromosómico se conocen desde hace tiempo. En la trisomía 21, por ejemplo, un cromosoma completo está presente tres veces en lugar de dos. En los síndromes de microdeleción, como el de Williams-Beuren, Prader-Willi o Smith-Magenis, faltan secciones más o menos definidas de un cromosoma, normalmente a una escala submicroscópica de unas pocas megabases. En el caso de las enfermedades monogenéticas, recientemente se han descubierto con creciente frecuencia deleciones o duplicaciones de genes individuales o de segmentos de genes como causa de la enfermedad.

Las técnicas utilizadas hasta la fecha en el diagnóstico de tales cambios en la dosis de los genes tienen sus limitaciones: Por ejemplo, aunque los métodos citogenéticos moleculares, como el FISH, o los métodos genéticos moleculares, como el MLPA, pueden utilizarse con una resolución alta o máxima, deben conocer o asumir a priori qué zona del genoma está afectada. Por otro lado, la citogenética clásica o la técnica CGH («hibridación genómica comparativa»: La hibridación comparativa del ADN del paciente y del ADN de referencia en cromosomas metafásicos) puede cubrir todo el genoma, pero la resolución está limitada a unos 5 Mb en el mejor de los casos debido al uso del microscopio de luz.

Para superar estas limitaciones de las técnicas existentes, la CGH de arrays es una alternativa adecuada.

Aquí, la técnica convencional de CGH se combina con la experiencia adquirida en el análisis de expresión mediante microarrays: Los fragmentos de ADN definidos e inmovilizados en la superficie de un portaobjetos de vidrio sirven como objetivos de hibridación, y el término «matriz» se refiere a la disposición regular y en forma de cuadrícula de estos fragmentos. Los fragmentos se seleccionan para cubrir el genoma humano de la forma más uniforme posible.

Para el análisis, se cohíben en el array cantidades aproximadamente iguales del ADN del paciente y de un ADN genómico de referencia. Dado que las muestras de ADN del paciente y de referencia están marcadas con diferentes tintes fluorescentes, un cambio numérico en el genoma del paciente provoca un cambio de color en la señal fluorescente de los fragmentos individuales a través de un cambio en la relación de hibridación.

Representación esquemática de la técnica de CGH en array:

en escáner detecta las señales fluorescentes y registra los cambios de color. Con el software adecuado, las señales se asignan a la región del gen y, finalmente, el resultado puede visualizarse, por ejemplo, como un «cariograma», que muestra en qué punto de un cromosoma hay cambios.

Visualización de un resultado del array CGH: duplicación de la región Xp11-p21.1 (creado en el ZMG con CGHAnalytics, Agilent)

El número y la densidad de los fragmentos en el array determinan la resolución del array CGH. En la actualidad, existen arrays con cobertura de todo el genoma humano con resoluciones que van desde 1 Mb hasta unos 35 kb. Debido al creciente número de fragmentos por matriz, la resolución seguirá aumentando. De este modo, se pueden detectar de forma fiable los desequilibrios de los genes individuales.

Aplicaciones de la CGH en array

La CGH en array es, por tanto, una técnica en la que se puede examinar el genoma completo de un paciente a alta resolución para detectar desviaciones de la dosis genética normal. Cada vez adquiere más importancia como método de cribado innovador, aunque en un principio se utilizó principalmente en el diagnóstico de tumores. Esto se debe a que la progresión del tumor se caracteriza por una acumulación de aberraciones que puede ir acompañada de la amplificación de oncogenes y la supresión de genes supresores de tumores.

El arrayCGH es de especial interés para el diagnóstico de casos de retraso mental inexplicable. En la citogenética estándar, las aberraciones son visibles en alrededor del 5% de los casos en pacientes con retraso mental y signos adicionales de dismorfia o agrupación familiar. El cribado de subtelómeros con FISH o MLPA puede encontrar una causa en otro 5% de los casos. Estudios recientes muestran que el array CGH con una resolución de aproximadamente 1 Mb revela desequilibrios genómicos en el 10-15 % de los pacientes con un cariotipo poco visible y hallazgos negativos de subtelómeros. (ver bibliografía). Se supone que esta tasa de detección aumentará a medida que aumente la resolución de las matrices. Algunos grupos de investigación ya recomiendan el array CH como primer paso diagnóstico en casos de retraso mental inexplicable.

Sin embargo, el array CH no sólo detecta nuevos desequilibrios, sino que también puede utilizarse para determinar con precisión el tamaño de la deleción, la ubicación de los puntos de rotura o el origen del material adicional en casos de pérdida o ganancia de regiones cromosómicas visibles desde el punto de vista citogenético. Esto es importante para una correlación genotipo-fenotipo precisa y para identificar los genes candidatos implicados en el desarrollo de la RM y la dismorfia. En algunas anomalías cromosómicas que anteriormente se consideraban translocaciones «equilibradas», el array CGH ha podido demostrar que el material genético está eliminado o duplicado en la región de los puntos de rotura y que, por tanto, existe una translocación desequilibrada. Así, con la ayuda del array CGH, los hallazgos citogenéticos se hacen más precisos y se corrigen.

Así, aunque los límites entre la citogenética y la genética molecular son cada vez más difusos, el cariotipo sigue siendo importante porque ciertas alteraciones cromosómicas no son detectables con el array CGH: Poliploidías, verdaderas translocaciones equilibradas y estados de mosaico con una pequeña proporción de células aberrantes.

Debido a la alta tasa de detección sobre el genoma completo y al hecho de que no es necesario un cultivo celular que requiera mucho tiempo y trabajo, el array CGH abre nuevas posibilidades para el diagnóstico prenatal.

Pero con todas las ventajas y posibilidades de esta técnica pionera, no hay que olvidar que el salto de la investigación al diagnóstico apenas se está produciendo aquí. Por lo tanto, el array CGH no sólo aclara cuestiones abiertas, sino que la interpretación de los resultados también puede plantear nuevas preguntas:

A través de los estudios de array CGH, se ha descubierto que el genoma humano contiene una proporción inesperadamente alta de regiones cuyo número de copias varía en los seres humanos fenotípicamente normales (véase la bibliografía). El tamaño de estas VNC («variaciones del número de copias») oscila entre unas pocas kilobases y varias megabases. Se calcula que cada individuo es portador de al menos 3-11 variaciones de este tipo. Las bases de datos que recogen este tipo de polimorfismos (es decir, las mutaciones que no afectan de forma evidente al fenotipo) acaban de crearse y, por tanto, aún están incompletas. Si ahora se encuentran aberraciones en el ADN de un paciente mediante una matriz de CGH, a menudo se especula si éstas son responsables del fenotipo en absoluto. En la mayoría de los casos, es necesario examinar también el ADN de los padres.

La probabilidad de que una aberración cromosómica sea causante de una enfermedad aumenta

• con el tamaño de la aberración
• si está presente «de novo», los padres no son portadores de esta aberración
• si no figura en ninguna base de datos de polimorfismos
• si están afectados genes que puedan asociarse con el fenotipo observado
• si se conocen casos con la misma aberración o con una similar que muestren un fenotipo parecido.

Cuanto más se utilice el array CGH en el diagnóstico clínico, más probable será que el diseño del array se adapte a las demandas de este campo: Al evitar las regiones de VNC conocidas y favorecer las regiones cromosómicas y los genes implicados en el retraso mental y los síndromes dismórficos, los arrays serán cada vez más interesantes para el diagnóstico pre y postnatal.

Nuestro instituto ha marcado el rumbo para aprovechar la tecnología de arrays ahora y poder recoger los futuros avances de forma inmediata. Hemos optado por equipos técnicos que también pueden evaluar arrays con la más alta resolución de forma fiable y reproducible.

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Referencias

Array CGH en el retraso mental

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Array-CGH in der Pränataldiagnostik

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Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

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