Proteínas fluorescentes de A. victoria
Las propiedades espectrales de la GFP o de sus variantes radican en la estructura de aminoácidos que forman el cromóforo (Figura 1). Puede tratarse de los tres aminoácidos situados en las posiciones 65-67 o de residuos cercanos a esta ubicación (por ejemplo, la YFP). Además de las principales mutaciones relativas al cromóforo, también se investigó sobre otras mutagénesis dirigidas al sitio para mejorar otros factores como la maduración de la proteína y la expresión en sistemas celulares heterólogos (por ejemplo, el uso de codones, el plegamiento de la proteína a temperatura fisiológica). Hay que tener en cuenta que A. victoria es un organismo marino relativamente primitivo sin sistema de calor corporal.
Aunque la GFP es una de las PF más populares por su brillo y alta fotoestabilidad, tiene dos desventajas principales. Estos son una cierta sensibilidad al pH y una ligera tendencia a la dimerización. La dimerización u oligomerización es un problema de muchos FPs. Su preferencia por aglutinarse entre sí puede producir artefactos o interpretaciones erróneas sobre la localización y la función de la proteína fusionada. Pero los científicos también han encontrado algunas respuestas a este problema. Las mutaciones en posiciones críticas (F223R, L221K y A206K) en las que se sustituyen aminoácidos no polares por otros hidrofílicos muestran una menor dimerización. Todos los cambios genéticos que conducen a una mejora de las características tanto espectrales como prácticas se resumen bajo el nombre de PFs «mejorados».
En el caso de la wtGFP, las mejoras conducen a una EGFP (enhanced GFP) con un único pico de excitación a 488 nm en lugar del complejo espectro de absorción anterior a 395 nm y 475 nm. La primera versión mutada de la wtGFP (el mutante S65T) desarrollada por Roger Tsien et al. era cinco veces más brillante que la original y mostraba un tiempo de maduración más corto. Junto con una mejor eficiencia de maduración a 37°C, basada en otra mutación (F64L), esto juega un papel importante para las personas que observan células vivas.
Una variante de GFP muy interesante con uno de los mayores desplazamientos de Stokes es Sapphire. Una mutación en una posición cercana al cromóforo (T203I) conduce a una alteración del máximo de excitación a 399 nm y del máximo de emisión a 511 nm. Esto supone un desplazamiento de Stokes de 112 nm. La esmeralda es otra modificación de la GFP con una fotoestabilidad y brillo mejorados y un plegamiento más eficiente en las células de mamíferos.
Mientras que todas las proteínas fluorescentes verdes tienen un brillo relativamente alto, las proteínas fluorescentes azules normalmente sufren una intensidad de emisión reducida en las aplicaciones microscópicas. No obstante, se utilizan en ensayos ópticos debido a otras propiedades espectrales. La EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) se construyó mediante varias rondas de mutaciones de la wtGFP. La primera (Y66H) saltó el pico de emisión del espectro verde al azul. Siguieron más mutaciones, produciendo una proteína con un máximo de excitación a 380 nm y un máximo de emisión a 448 nm. Estas propiedades espectrales la convierten en una compañera de la EGFP en la microscopía FRET. Las proteínas azules fluorescentes más recientes con mayores rendimientos cuánticos y mejor fotoestabilidad son Azurita, SBFP2 y EBFP2. Un prometedor sucesor de la EBFP es una proteína llamada Sirius que se hizo popular por su altísima tolerancia al pH (estable de pH 3-9) y su reputación de ser la proteína fluorescente con la longitud de onda de emisión más corta hasta la fecha.
Una segunda clase «azul» de variantes de GFP está formada por las proteínas fluorescentes cian: CFP. La sustitución de tirosina por triptófano (Y66W) y otras alteraciones genéticas conducen a un fluorocromo con mayor brillo y fotoestabilidad. Esta ECFP tiene un espectro de excitación y emisión bimodal a 433/445 nm y 475/503 nm. La luminosidad es sólo un 40% de la de la EGFP. Una variante destacada de la ECFP es Cerulean, que tiene un mayor coeficiente de extinción y rendimiento cuántico. Es 1,5 veces más brillante que la ECFP y se utiliza como pareja de FRET con la YFP.
Una mutación de la GFP que no altera directamente uno de los tres aminoácidos centrales del cromóforo dio lugar a la aparición de proteínas fluorescentes amarillas. Las YFP tienen una treonina común en la posición 203 que se intercambia por una tirosina (T203Y). Este aminoácido forma parte del barril β y se encuentra muy cerca del cromóforo. En comparación con la GFP, las propiedades de excitación y emisión se han desplazado a longitudes de onda más largas con máximos de excitación y emisión a 514 nm y 527 nm (EYFP). Una característica de la EYFP es su sensibilidad al pH. A un pH de 6,5, la EYFP sólo tiene alrededor del 50 % de su fluorescencia, lo que no siempre es una desventaja. Cuando se trata de medir el pH (por ejemplo, de vesículas, endosomas, etc.), la EYFP puede utilizarse como indicador. Resulta interesante que otra mutación (Q69M) haya desarrollado una mejor estabilidad al ácido y haya mejorado drásticamente su brillo (un 75 % más brillante que la EGFP). Esta proteína, que sigue teniendo una pobre fotoestabilidad en comparación con la EGFP, se denominó Citrina. Otro mutante de la YFP (F46L) mostró una velocidad de maduración drásticamente más rápida y también una mayor resistencia al pH. Esta proteína se denominó Venus y es un aceptor FRET frecuente con Cerulean.