Vírus e células
Sem indicação em contrário, todos os experimentos foram realizados usando um isolado clínico do vírus da influenza em células MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1) gentilmente fornecido pelo Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, EUA) . Os vírus descritos na Fig. 5 foram gentilmente fornecidos pelos colegas listados nos Agradecimentos.
Células MDCK e células MDCK-SIAT1 transfectadas estavelmente com 2,6-sialiltransferase para melhor expressão de oligossacarídeos Neu5Ac2-6Gal-terminados foram descritos anteriormente . Nós propagamos ambos os tipos de células em DMEM (Gibco) suplementados com 2 mM de L-glutamina, 10% de soro fetal de bezerro e antibióticos (estreptomicina, 100 mg/ml e penicilina, 100 U/ml).
Overlay media
Como meio de manutenção líquido (MM) para infecção por vírus, utilizamos MEM de Eagle contendo L-glutamina, 0,1% BSA (Sigma, A-0336), antibióticos e 1 μg/ml TPCK trypsin (Sigma, T-1426).
Cascas de 1,8% de Bacto-Agar (BD, 214010) e 2% de metilcelulose (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s a 2%, Fluka) em água destilada foram preparadas como descrito anteriormente .
O fabricante do Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) gentilmente forneceu três tipos de Avicel (RC-581, RC-591 e CL-661) para testes. Preparamos suspensões em stock de Avicel dispersando 2,4 g de Avicel em pó em 100 ml de água destilada num agitador magnético standard durante 1 hora. As reservas de ágar, MC e Avicel foram esterilizadas em autoclave durante 20 min a 121°C e armazenadas à temperatura ambiente.
As sobreposições foram preparadas misturando soluções de reserva de MC, Avicel ou ágar fundido com volumes iguais de meio de manutenção de dupla resistência. Para variar a concentração de MC e Avicel nas sobreposições, diluímos os estoques originais com água estéril. A sobreposição do ágar foi preparada a 42-44°C, duas outras sobreposições foram preparadas a 20 ou 37°C.
Concentrada (2,4%) Os estoques de Avicel tipicamente não se separaram durante o armazenamento, as sobreposições baseadas em Avicel diluídas, entretanto, foram menos estáveis. Se considerado necessário, nós misturamos os estoques de Avicel, e sempre misturamos as sobreposições de Avicel antes do uso, apertando com a mão ou com vortex. A separação lenta das sobreposições após sua aplicação nas monocamadas celulares não afetou os resultados do ensaio.
Ensaio em placas de 6 poços
Uma hora após infectar as monocamadas celulares com 30-50 unidades formadoras de placa do vírus em 1 ml de meio de manutenção sem tripsina, removemos o inóculo do vírus, cobrimos as células com 3 ml dos diferentes meios de sobreposição e incubamos culturas a 35°C em atmosfera de 5% de CO2. No caso das sobreposições de MC e Avicel, tomou-se o cuidado de não perturbar as placas durante o período de incubação, a fim de evitar a formação de placas não uniformes. Após três dias de incubação, removemos as sobreposições e fixamos as células. As sobreposições de ágar foram removidas com espátula metálica; as sobreposições de MC, Avicel e líquido foram removidas por sucção. As células foram fixadas com solução de paraformaldeído a 4% em MEM por 30 min a 4°C e lavadas com PBS. Todos os tratamentos subseqüentes das células foram realizados à temperatura ambiente. Permeabilizamos as células e simultaneamente bloqueamos os grupos de aldeídos residuais incubando as células por 10-20 min com 1 ml/poço de solução contendo 0,5% de Triton-X-100 e 20 mM de glicina em PBS. As células imuno-infectadas com vírus, incubando durante 1 hr com anticorpos monoclonais específicos para a nucleoproteína do vírus influenza A (gentilmente fornecida pelo Dr. Alexander Klimov do Centers for Disease Control, EUA), seguido de 1 hr de incubação com anticorpos anti-rato marcados com peroxidase (DAKO, Dinamarca) e 30 min de incubação com substratos de peroxidase de formação precipitada. Para a preparação de diluições de trabalho de imuno-reagentes foi utilizada uma solução de 10% de soro de cavalo normal e 0,05% de Tween-80 em PBS. Lavamos as células após os anticorpos primários e secundários incubando-as três vezes durante 3-5 min com 0,05% de Tween-80 em PBS. Como substratos peroxidase, empregamos o True Blue™ (KPL) pronto para uso ou solução de aminoethylcarbazole (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) preparada em tampão de acetato de sódio 0,05 M, pH 5,5 e contendo 0,03% H2O2. As placas manchadas foram lavadas com água da torneira para interromper a reação e secadas. No caso da coloração True Blue, que é relativamente instável em soluções de água, as placas foram secas invertidas a fim de minimizar a descoloração. As placas manchadas foram digitalizadas em um scanner de cama plana e os dados foram adquiridos pelo software Adobe Photoshop 7.0.
Como alternativa à coloração imunológica, em algumas experiências revelamos placas como áreas de células destruídas. Para isso, após a remoção das sobreposições, coramos as células com 1% de solução violeta cristalina em 20% de metanol em água.
Variantes de titulação de vírus em placas de 96 poços
1. Variante padrão
Infectamos monocamadas de células MDCK ou MDCK-SIAT1 em placas de 96 poços com 50 μl/poço de diluições em série do vírus no meio de manutenção sem tripsina. Após 1 h de incubação a 35°C em 5% de CO2, removemos o vírus, adicionamos 100 μl/poço de MC ou Avicel e incubamos as células durante mais 24 h para permitir a formação de placas. A fixação e coloração imunológica foram realizadas como descrito acima para placas de 6 poços mas utilizando 50 μl de reagentes por poço.
2. Variante simplificada
O ensaio foi realizado exactamente como na variante padrão com as seguintes modificações. Após 1 h de incubação com o vírus, não removemos o inóculo. Adicionámos 100 μl/poço de Avicel overlay media e misturámos a placa, quer batendo com a mão, quer utilizando um misturador de placas. A mídia incluiu quantidades aumentadas de tripsina (1,5 μg/ml) para compensar a diluição da cobertura com o material contendo o vírus presente nos poços.
Ensaio de inibição de flacidez
Noel Roberts (Roche Products, UK) gentilmente forneceu o inibidor de neuraminidase oseltamivir carboxilato (OC). Adicionamos 50 μl/poço de diluições em série de 10 vezes de OC em meio de manutenção sem tripsina (faixa de concentração de 4 nM a 400 μM OC) a monocamadas de células MDCK-SIAT1 em placas de 96 poços. Adicionamos então 50 μl/poço de diluições de vírus (20-40 unidades formadoras de placa por poço). Misturámos a placa e incubámo-la durante 1 h a 35°C para permitir o início da infecção viral. Em seguida, adicionamos 100 μl/poço de 1,2% de Avicel overlay media contendo 2 μg/ml de tripsina, incubamos as culturas durante 24 h e fixamos e mantivemos as placas como descrito acima.
No caso de placas de 6 poços, adicionamos 0,75 ml de alíquotas do medicamento e do inibidor e 1,5 ml de alíquota de Avicel por poço e mantivemos as placas imunologicamente 3 dias após a infecção.