Analiza și descrierea etapelor de formare a biofilmului de Aspergillus fumigatus cu ajutorul microscopiei electronice de scanare

Din punct de vedere medical, Aspergillus fumigatus este un agent patogen oportunist al indivizilor imunocompromiși, cu o severitate a bolii care depinde de statusul imunitar al gazdei, demonstrând o rată de mortalitate de 50-95%. Această ciupercă dă naștere la infecții locale, cum ar fi dermatomicoza unghiilor sau cheratita fungică, și la infecții invazive, cum ar fi aspergiloza, și reprezintă a doua cea mai frecventă cauză de infecții fungice la pacienții spitalizați. Infecția cu A. fumigatus în tractul respirator poate provoca micoză pulmonară, aspergiloză invazivă, aspergiloză pulmonară invazivă (IPA), pneumonită de hipersensibilitate, astm, rinită alergică mediată de imunoglobulina E, pneumonie necrozantă cronică sau aspergiloză bronhopulmonară alergică (ABPA). În plus, dă naștere la osteomielită și endocardită.

A. fumigatus dezvoltă un biofilm care poate fi unul dintre cei mai importanți factori de virulență . Biofilmul de A. fumigatus elaborează micelii încorporate într-un EMC in vitro, iar formarea biofilmului a fost descrisă în celulele epiteliale bronșice umane (HBE) și în celulele epiteliale bronșice de fibroză chistică (CFBEC) și la pacienții cu fibroză chistică . Formarea biofilmului fungic pe catetere și proteze contribuie la dezvoltarea infecțiilor nosocomiale. Prin urmare, persistența infecțiilor fungice se datorează capacității unei ciuperci de a forma biofilme pe o mare varietate de dispozitive medicale și pentru că celulele persistente reprezintă un mecanism important de rezistență. Terapia supusă unui biofilm stabilit în gazdă necesită, de obicei, administrarea de concentrații toxice de antimicrobiene, iar tratamentul recomandat include îndepărtarea dispozitivului contaminat; cu toate acestea, acesta este un proces dificil și costisitor. Prin urmare, biofilmele fungice reprezintă o problemă clinică și economică majoră .

În ultimul deceniu, au fost publicate mai multe studii privind biofilmul de A. fumigatus, atât in vivo (în modele murine, la pacienții cu aspergiloză pulmonară invazivă și în culturi epiteliale umane primare), cât și in vitro (pe plăci de polistiren). În general, aceste studii se referă în principal la stadiul de maturitate al biofilmului și la compoziția chimică a ECM, cu puține imagini ale stadiilor biofilmului, dar oricare dintre acestea a descris toate etapele formării biofilmului. Astfel, informațiile sunt diferite de contribuțiile aduse de grupul nostru de lucru .

Cele mai importante contribuții ale acestui studiu sunt următoarele: i) oferim o descriere a fiecărei etape de formare a biofilmului de A. fumigatus in vitro, în timp, iar etapele sunt susținute cu imagini SEM; ii) am analizat două origini diferite ale izolatelor: una din mediul înconjurător și una de la un pacient cu ulcer cornean; iii) raportăm microfișe (izolat clinic) și structuri fungice care au fost foarte puțin raportate până în prezent și care nu au fost descrise, după cunoștințele noastre, pentru specia Aspergillus; și iv) oferim o descriere a etapei de dispersie pentru formarea biofilmului de colonizare în puncte noi.

Pentru a analiza organizarea structurală a biofilmului matur de A. fumigatus (24 h de incubare la 28 °C și 37 °C), două tulpini, una din sol și alta de la un pacient cu cheratită fungică, au fost examinate prin SEM. O imagine de ansamblu a formării biofilmului de A. fumigatus observată în această cercetare a fost că aceste biofilme s-au comportat în mod similar, indiferent dacă izolatul provenea din sol sau din clinică; cu toate acestea, s-au prezentat diferențe în funcție de temperatura de incubare. La 28 °C, biofilmul a prezentat etape similare cu cele descrise în creșterea microbiană clasică: fazele lag, exponențială și staționară; creșterea biofilmului a fost lentă și stabilă, cu o producție scăzută de ECM, iar organizarea structurală a ciupercii a fost simplă (Fig. 1). La 37 °C, curba de performanță a arătat o fază lag (adaptare) și log (exponențială) destul de variabilă, care ar putea fi un răspuns la stresul datorat incubării la o temperatură ridicată; astfel, la 37 °C există o reducere a fazei de adaptare (lag) pentru a menține ciuperca viabilă; de asemenea, faza log, cu o creștere discontinuă și cu ambele comportamente este probabil un răspuns adaptativ . Astfel, la 37 °C, în timpul fazei de maturare, au existat structuri miceliare extrem de organizate, iar acestea au fost reduse și compactate cu hife îngroșate și fuzionate în anastomoze, iar ECM-ul a fost abundent în acoperirea, înconjurarea și întărirea structurilor fungice (Fig. 3 și 4).

În acest studiu, oferim dovezi ale stadiilor biofilmului de A. fumigatus prin SEM. Etapele observate în timpul formării biofilmului au fost următoarele:

Aderare, coagregare celulară și producție de EPS

Într-o etapă timpurie (Fig. 2/4 h), conidiile aderă la suprafața plăcii printr-o interacțiune a forțelor electrostatice între componentele structurale ale peretelui celular fungic, iar această forță de atracție este slabă și, prin urmare, reversibilă. Legătura ireversibilă și permanentă a fost descrisă pe scară largă în cazul adezivilor bacterieni specifici prezenți pe suprafața celulară, care se leagă de substrat și EPS, care sunt substanțe produse de microorganism în etapele inițiale ale formării biofilmului care funcționează în aderența celulelor între ele și cu substratul și sunt compuse din complexe proteice-carbohidrat și glicoproteine care îndeplinesc în principal funcții structurale sau adezive. Adezinele sunt implicate în recunoașterea celulelor bacteriene între ele, inclusiv în construirea de punți și inițierea formării de colonii . Adezinele sunt descrise în adeziunea fungică în timpul formării biofilmului. În biofilmele de Candida albicans, Candida glabrata și Candida tropicalis, există un grup de gene de adeziune implicate în formarea biofilmului care fac parte din familia de secvențe asemănătoare aglutininei (ALS), care joacă un rol esențial în acest proces și codifică proteine care posedă caracteristicile glicoproteinelor adezive de pe suprafața celulară. Familia ALS prezentă la C. albicans include opt gene (ALS1-ALS7 și ALS9) care codifică numeroase glicoproteine de suprafață. La A. fumigatus, pe suprafața conidelor au fost identificate șase hidrofobine, care cuprind rotițele RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp și RodFp. Această caracteristică hidrofobă permite aderența la proteinele celulelor gazdă, iar acestea ar putea fi implicate în aderarea la suprafața plăcii de polistiren și în inițierea procesului de formare a biofilmului la toate sau doar la două sau trei dintre acestea. În plus, Gravelat și colaboratorii au descris această interacțiune fungică și au constatat că adezina MedA controlează aderența la placa de polistiren, formarea biofilmului și expresia genelor de conidiere și că are efecte puternice asupra procesului de conidiere la A. fumigatus . Adeziunea, care rezultă din interacțiunea dintre adezinele fungice și suprafața plăcii, și adeziunea conidiu-conidiu declanșează probabil semnalizarea și promovează coagregarea celulară și producția de EPS, iar aceste evenimente sunt prezentate în Fig. 2 (4 h). În același timp, EPS accelerează formarea de colonii fungice prin legarea strânsă a celulelor (Fig. 2 (8-12 h)) .

Germinarea conidiului în hife și dezvoltarea

Formarea biofilmului necesită un număr limită de celule pentru a le permite să fie detectate și să genereze un răspuns, care este un mecanism de reglementare a expresiei genice cu funcții specifice . În formarea biofilmului de A. fumigatus, înainte de începerea germinării conidiale, suprafața conidiei este marcant hidrofobă și este compusă din 40 % grupe metil hidrofobe. Germinarea conidiilor de A. fumigatus are ca rezultat întreruperea stratului hidrofob proteic-rodular hidrofob și scoate la iveală pereții interni ai conidiilor, care sunt compuși în principal din polizaharide, care sunt componente hidrofile ale peretelui celular. Există un vârf hidrofob pe un singur spor care germinează. Conidiul își pierde progresiv hidrofobicitatea de suprafață și, după aceea, noul punct de creștere prezintă o coexistență de tije hidrofobe și polizaharide hidrofile . Germinarea conidială în hife începe cu formarea tuburilor germinative, așa cum este ilustrat în Fig. 2 (8-12 h), care posedă natura foarte hidrofilă a peretelui celular, și se așteaptă ca acestea să favorizeze creșterea ifelor .

Maturarea biofilmului

Maturizarea biofilmului de A. fumigatus a fost observată la 24 h, care este un timp de incubare similar cu cele raportate de alți cercetători. Componentele structurale includ ECM, care este prezentă în biofilmul matur și leagă celulele pentru a forma baza structurală a biofilmului, inclusiv EPS și multe micelii organizate (Fig. 2 (24 h0) . ECM. Apa cuprinde cea mai abundentă componentă și, în biofilm, reprezintă aproape 97 %. În acest mediu umed, există o rețea macromoleculară ordonată. Funcțiile majore descrise pentru EPS în biofilmele bacteriene sunt următoarele: adeziune, agregare celulară, coeziune; retenție de apă, barieră protectoare ca apărare specifică a gazdei sau agenți antimicrobieni, absorbție de compuși organici și ioni anorganici, activitate enzimatică, sursă de nutrienți, schimb de informații genetice, donator sau acceptor de electroni, export de componente celulare, stocare a excesului de retenție de energie și stabilizare a enzimelor . În biofilmele fungice, toate aceste funcții nu sunt încă descrise, dar unele dintre ele sunt în curs de studiu: forțele de coeziune și adezive ale matricei contribuie la stabilitatea arhitecturală și mecanică a biofilmului. Celulele fungice sunt imobilizate în matrice și acționează ca un ecosistem funcțional în continuă schimbare și reglare homeostatică, cu interacțiuni intense, inclusiv comunicarea celulă-celulă, care acționează ca un clei care ține celulele împreună . Structura biofilmului variază foarte mult în funcție de microorganismul care îl produce și de condițiile care îi înconjoară microhabitatul, inclusiv diferențele structurale asociate cu prezentarea clinică. În timpul proceselor infecțioase, ECM susține protecția împotriva gazdei, precum și rezistența la medicamente a microorganismelor; astfel, ECM nu este doar un cadru mecanic, ci și un regulator al comportamentului celular. Proteinele hidrofobe ale matricei se leagă cu receptorii specifici de pe suprafața celulară, ceea ce duce la adeziunea celulă-matrice, care exercită un efect asupra formei, migrației, proliferării, supraviețuirii și metabolismului celular. În plus, ECM protejează celulele împotriva insultelor din mediul înconjurător, inclusiv uscarea, ultravioletele (UV), radiațiile, oxidarea, înfometarea, acțiunea prădătorilor și a apărării imunitare a gazdei și a antibioticelor . Caracteristicile ECM au fost evidente în Fig. 2 (24 h) și Fig. 3 și au aderat la hifele fungice într-un înveliș contiguu și au fost observate, de asemenea, cu o consistență poroasă (Fig. 2 (24 h)). În biofilmul de A. fumigatus, EPS a fost foarte bine structurat și a avut o producție abundentă, care acoperea, înconjoară și întărește structurile fungice; acesta acționează ca un coerent pentru fuzionarea structurilor hifelor-hifae (numai la 37 °C). EPS apare cu un aspect mucos care aderă complet și acoperă hifele, provocând anastomoze și închide lumenul canalelor de apă (Fig. 2 (24 h), 3 și 4). În studii anterioare, grupul nostru de lucru a descris stadiul de maturare a biofilmului de A. fumigatus, în care au fost observate structuri similare .

În unele microconsorții, compoziția chimică a EPS este cunoscută (polimeri de carbohidrați, ADN și/sau proteine și, lipide, printre altele), dar altele rămân să fie identificate. Suprafața’-suprafața A. fumigatus este compusă din α-1,3-glucani, chitină, chitosan, galactomanan, galactosaminogalactan, melanină și proteine. Compoziția și organizarea structurală a peretelui celular se remodelează în mod constant; chiar dacă polizaharidele prezente sunt aceleași, cantitatea și localizarea lor variază în funcție de condițiile de creștere și de mediul nutrițional. În acest caz, am arătat compoziția chimică a biofilmului de A. fumigatus, care a fost observată prin colocalizarea prin CLSM a fluorocromilor atașați la chitină, a activității metabolice și a acizilor nucleici; în plus, s-a observat suprapunerea semnalelor fluorocromilor atunci când aceștia erau atașați la două sau trei dintre acestea (Fig. 5). Funcția descrisă pentru polizaharide, cum ar fi α 1,3-glucanii, a cuprins rolul predominant pe care aceștia îl au in vitro în agregarea hifelor și în agregarea hifelor în biofilme. Alte polizaharide din ECM, inclusiv galactomananul și galactosaminogalactanul, sunt, de asemenea, cunoscute ca având un rol în protejarea ciupercii și în aderența structurilor sale biofilmice la suprafețe . ADN extracelular (eADN) este o componentă importantă a biofilmului ECM care menține integritatea structurală și arhitecturală a lui A. fumigatus. ADNe este creat prin autoliză și a fost asociat în mod semnificativ cu nivelurile de rezistență antifungică (Fig. 5). În plus, eDNA poate fi un rezervor de gene pentru transferul orizontal de gene. ADN-ul conferă o organizare structurală mai solidă și mai rezistentă atunci când este colocalizat cu polizaharide. eDNA provine din celulele fungice datorită secreției de chitinaze de către A. fumigatus care favorizează eliberarea acestuia (Fig. 5) . În biofilm, modificarea peretelui celular exercită un impact esențial asupra rezistenței la medicamentele din peretele celular. La A. fumigatus, într-un model de biofilm de șoarece, în pompele de eflux multidrog rezistente (MDR) AfuMDR4 genele AfuMDR4 asociate cu ieșirea de antimicrobiene, gena a fost semnificativ indusă de tratamentul cu Voriconazol după 24 h . Markerul FUN1 a evidențiat activitatea metabolică care este o comunitate vie (Fig. 5).

Micelii: Biofilmul prezintă o structură tridimensională (3-D) complexă care reflectă un proces celular coordonat; dezvoltarea și expansiunea miceliului au fost evidente, care au inclus rețele compacte de stratificare a hifelor, aderența hifelor, anastomoze la ambele temperaturi, cu canale formate de aranjament spațial optim pentru a asigura influxul de nutrienți și efluxul de produse reziduale și astfel stabilizează biofilmul; la 37 °C, acest canal a fost mai evident (Fig. 2 (24 h), 3 și 4). În plus, aceste structuri au fost observate și de alți cercetători . Microhipofage: În stadiile timpurii de maturare a biofilmului, au fost observate structuri fungice neregulate, cum ar fi microhyphae, în izolatul clinic (Fig. 4). Acest fapt este relevant deoarece există puține referiri la microhyphae în literatura de specialitate, iar aceasta este prima dată când acestea au fost descrise la A. fumigatus. Microhyphae prezintă modificări ale citoscheletului care generează hife scurte și subțiri, cu pereți subțiri și cu capetele îndoite. Microhyphae sunt asociate cu o activitate enzimatică ridicată care favorizează procesul de maturare și dispersia celulară ulterioară în stadiul de biofilm .

Dispersia celulară

În timpul dispersiei celulare, o porțiune din biofilm se desprinde, porțiunea cuprinzând conidele sau hifele. S-a observat o dezvoltare asincronă a biofilmului, în special în stadiul de maturare a biofilmului, când noile conidii au fost capabile să germineze, producând o nouă creștere micelială și modificări ale ifelor, cum ar fi buclele (figurile 4 și 6). Dispersia celulară a biofilmului are loc ca răspuns la schimbările de mediu. Aceasta acționează pentru a îndepărta o substanță periculoasă din corpul principal al biofilmului. Acest proces duce la diseminarea și propagarea celulelor biofilmului care rămân în interior într-o nouă locație, care este susținută de evenimente moleculare complexe . Biofilmele pot fi văzute ca niște învelișuri protectoare ale celulelor vii de dedesubt, cu funcții extrem de complexe și nenumărate și, astfel, acestea sunt construcții biologice cu adevărat remarcabile. Biofilmele asigură protecție împotriva prădătorilor sau a atacurilor chimice și oferă celulelor interioare un mediu pentru comunicarea intracelulară, fluxul de nutrienți și transferul de material genetic. Dispersia celulară diseminează celulele viabile în alte locații din mediul înconjurător sau în interiorul unei gazde, unde celulele se pot reproduce, facilitând astfel persistența acesteia. Dispersia celulară are loc ca urmare a condițiilor de nutrienți din mediul înconjurător limitate și, prin urmare, este un mecanism de supraviețuire. Prin urmare, dispersia celulară este importantă nu numai pentru promovarea diversității genetice, ci și pentru a scăpa de habitatele nefavorabile, ajutând la dezvoltarea de noi nișe și la persistența microorganismului într-o nouă locație .

.