Specimen Requirements and Procedure
ELISA se efectuează în plăci de polistiren, de obicei în plăci cu 96 de godeuri acoperite pentru a lega foarte puternic proteinele. În funcție de tipul de ELISA, testarea necesită un anticorp de detecție primar și/sau secundar, analit/antigen, anticorp de acoperire/antigen, tampon, spălare și substrat/cromogen. Anticorpul de detecție primar este un anticorp specific care se leagă numai de proteina de interes, în timp ce un anticorp de detecție secundar este un al doilea anticorp conjugat cu o enzimă care se leagă de un anticorp primar care nu este conjugat cu o enzimă.
Există patru etape generale principale pentru finalizarea unui imunoanaliză ELISA. Aceste etape sunt:
-
Învelișul (fie cu antigen, fie cu anticorp)
-
Blocarea (de obicei prin adăugarea de albumină serică bovină )
-
Detecția
-
Lectura finală
.
Detecția se realizează prin adăugarea unui substrat care poate genera o culoare. Există multe substraturi disponibile pentru a fi utilizate în detecția ELISA. Cu toate acestea, cele mai frecvent utilizate sunt peroxidaza de hrean (HRP) și fosfataza alcalină (ALP). Substratul pentru HRP este peroxidul de hidrogen și generează o schimbare de culoare albastră. ALP măsoară culoarea galbenă a nitrofenolului după perioade de incubare la temperatura camerei de 15 până la 30 de minute și utilizează de obicei P-Nitrofenil-fosfat (pNPP) ca substrat.
Între fiecare dintre cele patru etape de mai sus se face o „spălare” a plăcii folosind un tampon, cum ar fi soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și un detergent neionic, pentru a elimina materialul nelegat. Puțurile sunt spălate de două sau mai multe ori în timpul fiecărei etape de spălare, în funcție de protocolul specific urmat.
În protocolul ELISA, de obicei, în puțurile plăcii se plasează o diluție în serie de concentrații. După ce se măsoară rezultatele, se trasează o curbă standard din datele diluțiilor în serie, cu o concentrație pe axa x folosind o scară logaritmică și absorbția pe axa y folosind o scară liniară.
Există patru tipuri majore de ELISA:
-
ELISA direct (placă acoperită cu antigen; screening anticorpi)
-
ELISA indirect (placă acoperită cu antigen; screening antigen/anticorp)
-
ELISA sandwich (placă acoperită cu anticorpi; antigen de screening)ElISA competitiv (screening anticorp)
ElISA directă
Atât ELISA directă cât și indirectă începe cu acoperirea cu antigen a plăcilor ELISA. Prima etapă de legare implică adăugarea antigenului pe plăci, care se incubează timp de o oră la 37 grade C sau poate fi incubat la 4 grade C peste noapte. După finalizarea etapei de incubație, următoarea etapă constă în spălarea plăcilor de orice potențial anticorp nelegat și blocarea oricărui situs nelegat de pe placa ELISA cu ajutorul unor agenți precum BSA, ovalbumină, aprotinină sau alte proteine animale. Această a doua etapă este importantă deoarece previne legarea oricăror anticorpi nespecifici pe placă și minimizează rezultatele fals-pozitive. După adăugarea tamponului, placa se spală din nou și se adaugă un anticorp de detecție primar conjugat cu o enzimă selectată. Placa este incubată în continuare timp de o oră.
Într-un ELISA direct, anticorpul primar de detecție se leagă direct de proteina de interes. Apoi, placa este spălată din nou pentru a îndepărta orice anticorp nelegat și este urmată de adăugarea unui substrat/cromofor, cum ar fi fosfataza alcalină (AP) sau peroxidaza de hrean (HRP) pe placă, ceea ce duce la o schimbare de culoare. Schimbarea de culoare a probei are loc fie prin hidroliza grupărilor fosfat din substrat de către AP, fie prin oxidarea substraturilor de către HRP. Avantajele utilizării ELISA direct includ eliminarea reactivității încrucișate a anticorpilor secundari și, datorită numărului mai mic de etape, este rapid în comparație cu ELISA indirect. Dezavantajele sale includ sensibilitatea scăzută în comparație cu celelalte tipuri de ELISA și costul ridicat al reacției.
Eliminarea ELISA indirectă
Etapele ELISA indirectă sunt identice cu ELISA directă, cu excepția unei etape suplimentare de spălare și a tipurilor de anticorpi adăugați după ce tamponul este eliminat. ELISA indirect necesită doi anticorpi, un anticorp primar de detecție care se lipește de proteina de interes și un anticorp secundar legat enzimatic complementar anticorpului primar. Se adaugă mai întâi anticorpul primar, urmat de o etapă de spălare, iar apoi se adaugă și se incubează anticorpul secundar conjugat cu enzima. După aceasta, etapele sunt aceleași ca și în cazul ELISA direct, care include o etapă de spălare, adăugarea substratului și detectarea unei modificări de culoare.
ElISA indirect are o sensibilitate mai mare în comparație cu ELISA direct. De asemenea, este mai puțin costisitor și mai flexibil datorită numeroșilor anticorpi primari posibili care pot fi utilizați. Singurul dezavantaj major al acestui tip de ELISA este riscul de reactivitate încrucișată între anticorpii secundari de detecție.
Sandwich ELISA
În comparație cu ELISA directă și indirectă, ELISA sandwich începe cu un anticorp de captare acoperit pe godeurile plăcii. Se numește „sandwich” deoarece antigenele sunt așezate între două straturi de anticorpi (anticorpi de captare și anticorpi de detectare). După adăugarea anticorpului de captură pe plăci, plăcile sunt acoperite și incubate peste noapte la 4°C. După finalizarea etapei de acoperire, plăcile sunt spălate cu PBS, apoi tamponate/blocate cu BSA. Spălările cu tampon se efectuează timp de cel puțin 1-2 ore la temperatura camerei. În cele din urmă, placa se spală din nou cu PBS înainte de adăugarea antigenului.
Antigenul de interes se adaugă apoi pe plăci pentru a se lega de anticorpul de captare și se incubează timp de 90 de minute la 37 de grade C. Placa se spală din nou, iar anticorpul primar de detecție se adaugă apoi pe placă și se incubează timp de încă 1-2 ore la temperatura camerei, urmat de o spălare cu tampon. Apoi se adaugă anticorpul secundar conjugat cu o enzimă și se incubează timp de încă 1 până la 2 ore. Placa se spală din nou și se adaugă substratul pentru a produce o schimbare de culoare. Testul ELISA sandwich are cea mai mare sensibilitate dintre toate tipurile de ELISA. Dezavantajele majore ale acestui tip de ELISA sunt timpul și cheltuielile și utilizarea necesară a „perechilor potrivite” (antigen divalent/multivalent) și a anticorpilor secundari.
ElISA competitiv
ElISA competitiv testează prezența unui anticorp specific pentru antigene în serul de test. Acest tip de ELISA utilizează doi anticorpi specifici, un anticorp conjugat cu o enzimă și un alt anticorp prezent în serul de test (în cazul în care serul este pozitiv). Combinarea celor doi anticorpi în godeuri va permite o competiție pentru legarea la antigen. Prezența unei modificări de culoare înseamnă că testul este negativ, deoarece anticorpul conjugat cu enzima s-a legat de antigeni (nu de anticorpii din serul de test). Absența culorii indică un test pozitiv și prezența anticorpilor în serul de test. Testul ELISA competitiv are o specificitate scăzută și nu poate fi utilizat în cazul probelor diluate. Cu toate acestea, avantajele constau în faptul că este necesară o purificare mai mică a probei, poate măsura o gamă largă de antigene într-o probă dată, poate fi utilizată pentru antigene mici și are o variabilitate scăzută.
.