Căi de apoptoză extrinsecă versus intrinsecă în chimioterapia anticanceroasă

Semnalizare prin calea intrinsecă a apoptozei

În calea mitocondrială a apoptozei, activarea caspazei este strâns legată de permeabilizarea membranei mitocondriale externe de către membrii proapoptotici ai familiei Bcl (Green și Kroemer, 2004). Numeroși stimuli citotoxici și molecule transmițătoare de semnale proapoptotice converg asupra mitocondriilor pentru a induce permeabilizarea membranei mitocondriale externe (Decaudin et al., 1998; Green și Kroemer, 2004). Această permeabilizare este reglată de proteinele din familia Bcl-2, de lipidele mitocondriale, de proteinele care reglează fluxul de metaboliți bioenergetici și de componentele porului de tranziție de permeabilitate (Green și Kroemer, 2004). În urma ruperii membranei mitocondriale externe, se eliberează un set de proteine care se găsesc în mod normal în spațiul dintre membrana mitocondrială internă și cea externă, inclusiv citocromul c, Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, AIF și endonucleaza G (Saelens et al., 2004). Odată ajunse în citosol, aceste proteine apoptogene declanșează execuția morții celulare prin promovarea activării caspazelor sau acționând ca efectori de moarte independenți de caspaze (Saelens et al., 2004).

Mediatori mitocondriali ai apoptozei dependente de caspază

Citocrom c

Liberarea de citocrom c din mitocondrii declanșează direct activarea caspazei-3 prin formarea complexului apoptosom care conține citocrom c/Apaf-1/caspază-9 (Cain et al., 2000). Odată ajuns în citosol, citocromul c se leagă de regiunea C-terminală a Apaf-1, o proteină citosolică cu un domeniu N-terminal de recrutare a caspazelor (CARD), un domeniu de legare a nucleotidelor cu omologie cu CED-4 din Caenorhabditis elegans și un domeniu C-terminal care conține 12-13 repetări WD-40 (Zou et al., 1997). Legarea citocromului c la Apaf-1 facilitează asocierea dATP cu Apaf-1 și expune CARD-ul său N-terminal, care poate acum să se oligomerizeze și să devină o platformă pe care caspaza inițiatoare-9 este recrutată și activată printr-o interacțiune CARD-CARD (Adrain et al., 1999). În mod consecutiv, caspaza executantă-3 este recrutată în apoptosom, unde este activată de caspaza-9 rezidentă (Bratton et al., 2001). Caspaza-3 clivează apoi substraturile cheie din celulă pentru a produce multe dintre evenimentele celulare și biochimice ale apoptozei.

În anumite cazuri, activitatea caspazei instigată de citocromul c citosolic contribuie la scăderea metaloproteinazei matriciale (MMP), așa cum s-a demonstrat prin utilizarea inhibitorilor sintetici ai caspazei și a celulelor Apaf1 -/- (Waterhouse et al., 2001). În plus, activitatea caspazei dăunează și mai mult funcției mitocondriilor permeabilizate prin afectarea activității complexelor I și II, ceea ce duce inevitabil la pierderea MMP și la generarea de specii reactive de oxigen (Ricci et al., 2004). Astfel, evenimentele secundare care rezultă din modificările citosolice, cauzate de eliberarea citocromului c și a altor proteine IMS mitocondriale, se pot întoarce asupra mitocondriilor permeabilizate și pot afecta funcția acestora. În mod important, această buclă de amplificare mitocondrială a activității caspazei poate determina în mod critic răspunsul celulelor canceroase la tratamentele citotoxice.

În plus, există dovezi recente pentru existența unui mecanism (unor mecanisme) de activare a caspazei independente de citocrom c și apoptosome, dar dependente de Apaf-1. Un knock-in țintit al unei variante a citocromului c care nu are proprietăți apoptogene, dar are transfer de electroni și activitate antioxidantă (K72A), a permis evaluarea contribuției citocromului c la apoptoză fără a afecta funcția sa în fosforilarea oxidativă (Hao et al., 2005). În mod interesant, timocitele provenite de la șoarecii KA/KA au fost mult mai sensibile la stimuli de moarte, inclusiv la etopozid și γ-iradiere, decât timocitele Apaf-1(-/-) (Hao și colab., 2005). La tratamentul cu γ-iradiere, propaszele au fost activate în mod eficient în timocitele KA/KA apoptotice, dar nu s-a observat oligomerizarea Apaf-1 (Hao et al., 2005) indicând o cerință diferențiată pentru citocrom c și Apaf-1 în apoptoză.

Smac/DIABLO

Alte proteine eliberate din mitocondrii, cum ar fi Smac/DIABLO și Omi/HtrA2, facilitează activarea caspazelor prin neutralizarea inhibitorilor endogeni ai caspazelor, proteinele inhibitoare ale apoptozei (IAPs). Smac și omologul său murin DIABLO sunt proteine mitocondriale codificate nuclear, care conțin un semnal de localizare mitocondrială, care este eliminat proteolitic la importul mitocondrial pentru a produce proteina matură de 23 kDa (Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000). Această etapă de maturare expune motivul de legare a IAP (IBM) la extremitatea N-terminală a Smac/DIABLO (Du et al., 2000) (tabelul 1). S-a demonstrat că al doilea activator al caspazei/DIABLO derivat din mitocondrii se leagă de XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin și Apollon într-un mod dependent de BIR (Vaux și Silke, 2003) (figura 2),și acționează ca homodimer cu IBM prezent într-o configurație bivalentă (Chai et al., 2000). Un dimer Smac/DIABLO se leagă de o moleculă XIAP prin ambele motive de legare a IAP, unul interacționând cu BIR2 și celălalt cu BIR3 (Huang et al., 2003). În mod intrigant, aceeași canelură BIR3 se leagă de IBM expusă la extremitatea N-terminală (Ala-Thr-Pro-Phe) a subunității mici a caspazei-9 în urma procesării autocatalitice a acesteia după Asp315, permițând Smac/DIABLO să deplaseze caspaza-9 de la XIAP (Srinivasula et al, 2001) (tabelul 1).

Funcția mitocondrială fiziologică a Smac/DIABLO este necunoscută, iar șoarecii DIABLO -/- par normali (Okada et al., 2002). Deși scindarea in vitro a procaspazei-3 la adăugarea de citocrom c a fost inhibată în lizații de celule Smac -/-, șoarecii Smac -/- și celulele Smac -/- au răspuns în mod normal la stimuli apoptotici, cum ar fi iradierea UV, staurosporina, etoposidul și TNF/ciclohexamida (Okada et al., 2002). Aceste observații sugerează existența unor factori redundanți care compensează pierderea Smac/DIABLO, posibil HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 este o proteină de 49 kDa, codificată nuclear, cu un semnal de localizare mitocondrială N-terminal care mediază translocarea sa în spațiul intermembranar mitocondrial (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 este transformat în spațiul intermembranar în forma matură de 37 kDa, eliberând un IBM la extremitatea sa N-terminală (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (tabelul 1) (tabelul 1). Deși Omi/HtrA2 recombinant își poate cataliza propria maturare in vitro, proteaza responsabilă pentru maturarea sa în celule rămâne necunoscută (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 joacă un rol esențial în reglarea homeostaziei mitocondriale, necesitând activitatea sa proteolitică, deși țintele moleculare și partenerii de interacțiune ai Omi/HtrA2 în mitocondrie nu au fost încă definite (Saelens et al., 2004). Odată ce Omi/HtrA2 este eliberat din mitocondrie în citosol, promovează moartea celulară într-un mod dependent de caspază, prin antagonizarea IAP-urilor, și într-un mod independent de caspază, ca protează (Saelens et al., 2004). Similar cu Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 blochează IAPs prin motivul său N-terminal de legare la IAP, prezentat într-o configurație trimerică (Li et al., 2002)

Deși eliberarea citocromului c în citosol declanșează direct activarea caspazei-3 prin formarea complexului apoptosom care conține citocrom c/Apaf-1/caspază-9, Smac/DIABLO și Omi/HtrA2 promovează indirect activarea caspazei prin antagonizarea efectelor inhibitoare ale IAP-urilor (Saelens et al., 2004). Astfel, există un echilibru dinamic între moleculele efectoare pro- și antiapoptotice, care permite celulei să facă față unei deteriorări mitocondriale limitate, caz în care IAPs pot bloca în mod adecvat activarea caspazei inițiată de o cantitate mică de citocrom c eliberat. Cu toate acestea, în circumstanțe în care leziunile mitocondriale avansează sau afectează simultan mai multe mitocondrii, obstacolul antiapoptotic impus de IAP-uri poate fi depășit de concentrația citosolică mai mare a antagoniștilor lor Smac/DIABLO și HtrA2/OMI, care neutralizează IAP-urile prin legare directă.

Există tot mai multe dovezi că celulele canceroase au o tendință intrinsecă de apoptoză care este ținută în frâu de IAP-uri. În acest scop, în diverse linii celulare tumorale și țesuturi canceroase, dar nu și în celulele normale, au fost detectate niveluri bazale ridicate ale activităților caspazei-3 și caspazei-8 și fragmente active ale caspazei-3 în absența apoptozei (Yang et al., 2003a). Celulele tumorale, dar nu și celulele normale, au exprimat, de asemenea, niveluri ridicate de IAP, ceea ce sugerează că expresia crescută a IAP a contracarat activitatea caspazei bazale ridicate în mod selectiv în celulele tumorale (Yang et al., 2003a). Prin urmare, strategiile care vizează IAPs sunt considerate ca fiind o abordare promițătoare pentru a spori eficacitatea terapiilor citotoxice în mod selectiv în celulele canceroase. În acest scop, exprimarea Smac/DIABLO prin transfecție a Smac/DIABLO a redus pragul de ucidere indusă de TRAIL în diferite tumori (Ng și Bonavida, 2002; Okano și colab., 2003) și, de asemenea, a sensibilizat celulele canceroase la chimioterapie (McNeish și colab., 2003; Zhao și colab., 2006). Cu toate acestea, translocarea Smac/DIABLO endogenă în citosol în timpul apoptozei induse de medicamente anticancerigene nu pare să joace un rol major în anumite condiții, de exemplu, în celulele de carcinom pulmonar uman la tratamentul cu etoposidă (Bartling et al., 2004). Reducerea Smac/DIABLO prin ARN de interferență mică (siRNA) nu a influențat distrugerea prin etopozidă în aceste celule, deși o peptidă Smac-N7 care se leagă de IAP a îmbunătățit apoptoza indusă de etopozidă (Bartling et al., 2004). Aceste date sugerează că deficitul de Smac/DIABLO poate fi compensat prin acțiunea unor determinanți redundanți în anumite celule canceroase.

Mediatori mitocondriali ai apoptozei independente de caspază

După eliberarea sa din spațiul intermembranar mitocondrial, HtrA2/OMI contribuie la moartea celulară și într-un mod independent de caspază, ca protează, în plus față de promovarea apoptozei într-un mod dependent de caspază prin antagonizarea IAPs (Suzuki et al, 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Datele in vitro au demonstrat degradarea XIAP, cIAP1, cIAP2 și Apollon de către activitatea de protează a HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). În plus, Trencia et al. (2004) au demonstrat interacțiunea antiapoptoticului PED/PEA-15 cu HtrA2/OMI citosolic și degradarea acestuia de către acesta. Diminuarea nivelurilor de HtrA2/OMI în celule prin interferență antisens sau ARN scade sensibilitatea diferitelor linii celulare canceroase la moartea celulară indusă de staurosporină, Fas, UV sau cisplatin (Martins et al, 2002).

În plus, AIF și endonucleaza G sunt eliberate din mitocondrii la permeabilizarea membranei mitocondriale externe și se translocă în nucleu pentru a contribui la condensarea cromatinei nucleare și la fragmentarea ADN pe scară largă (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). S-a discutat în mod controversat dacă aceste două proteine sunt eliberate înainte, împreună sau după citocromul c (Arnoult et al., 2002). De asemenea, nu este încă foarte clar modul în care AIF contribuie la fragmentarea ADN-ului nuclear, deoarece nu are activitate DNază intrinsecă. În celulele mamiferelor, ciclofilina A, o peptidil-prolil cis-trans izomerază, cooperează cu AIF pentru a induce descompunerea ADN-ului (Cande et al., 2004).

Distrugerea căii intrinseci în cancer

Mutațiile în genele implicate în reglarea căii mitocondriale sunt foarte frecvente în celulele canceroase. Deoarece majoritatea terapiilor anticancerigene induc apoptoza în celulele canceroase prin declanșarea căii intrinseci, astfel de mutații sunt de obicei asociate cu rezistența la tratament. De exemplu, supraexpresia Bcl-2, ca urmare a translocației cromozomiale a oncogenei bcl-2 în locusul genei lanțului greu al imunoglobulinei, este asociată cu aproximativ 85 % din limfomul folicular uman (Tsujimoto et al., 1984). Experimentele cu șoareci transgenici au demonstrat că supraexprimarea Bcl-2 poate favoriza transformarea neoplazică a limfocitelor B și T și a celulelor mieloide (McDonnell și Korsmeyer, 1991; Traver și colab., 1998).

După faptul că supraexprimarea membrilor antiapoptotici ai familiei Bcl-2 favorizează oncogeneza, rezultă că membrii proapoptotici cu domenii multi BH ai acestei familii acționează ca supresori tumorali. Cu toate acestea, din moment ce Bax și Bak au roluri care se suprapun în mare măsură în apoptoză, a fost dificil de determinat dacă această ipoteză este adevărată și, într-adevăr, șoarecii bax-/- nu sunt predispuși în mod pronunțat la neoplazie (Knudson et al., 2001). Cu toate acestea, mutații somatice care inactivează gena bax au fost găsite în anumite tumori solide și tumori hematologice maligne. În acest sens, au fost descrise mutații de substituție nucleotidică unică sau mutații de tip frameshift, care inactivează gena Bax în cancerul de colon cu deficit de reparare a nepotrivirii (MMR) sau în tumorile maligne hematopoetice (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

În plus, există tot mai multe dovezi că proteinele BH3-only pot contribui la suprimarea transformării maligne, ceea ce indică faptul că acestea pot funcționa ca supresori tumorali de bună credință. De exemplu, s-a demonstrat că pierderea unei singure alele a Bim a accelerat limfomageneza celulelor B indusă de exprimarea unei transgene c-myc (Egle et al., 2004), în concordanță cu rolul-cheie al Bim ca regulator al homeostaziei limfoide (Strasser, 2005). Este interesant faptul că, recent, au fost identificate deleții homozigote în regiunea cromozomială care găzduiește gena bim la pacienții cu limfom cu celule mantale (Tagawa et al., 2005). Șoarecii lipsiți de bid dezvoltă spontan o tulburare mieloproliferativă care poate evolua spre o malignitate asemănătoare cu leucemia mielomonocitară cronică (CMML) (Zinkel et al., 2003). Mai mult, s-a raportat că suprimarea mediată de RNAi a Puma accelerează limfomageneza indusă de Myc (Hemann et al., 2004).

În plus față de alterările genetice, expresia aberantă a proteinelor din familia Bcl-2 este reglementată în principal la nivel transcripțional sau post-transcripțional. De exemplu, expresia mai multor proteine antiapoptotice din familia Bcl-2, de exemplu, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 sau Bfl-1, este reglată transcripțional de NF-κB (Cory și Adams, 2002).

Pe lângă proteinele din familia Bcl-2, s-a constatat o activitate scăzută sau absentă a Apaf-1 în cancerul ovarian, melanom și leucemie. În plus, mutațiile în gena supresoare de tumori p53, cel mai frecvent defect genetic în cancerele umane, impietează asupra căii intrinseci. De exemplu, activarea p53 stimulează o serie de gene care posedă elemente sensibile la p53 prezente în promotorii lor, cum ar fi proteinele proapoptotice numai BH3 Puma, Noxa și Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Ca urmare, celulele în care p53 este stabilizat sunt sensibilizate pentru activarea căii mitocondriale de moarte celulară. În plus, p53 poate afecta direct integritatea mitocondrială fără a fi nevoie de activarea genei. Într-adevăr, s-a raportat că p53 se poate lega de Bcl-2 și Bcl-XL la nivelul mitocondriilor, promovând astfel destabilizarea mitocondrială (Mihara et al., 2003).

Semnalizarea prin intermediul căii intrinseci în terapia cancerului

Majoritatea agenților chimioterapeutici convenționali, de exemplu, etoposidul, doxorubicina, cisplatinul sau paclitaxelul, provoacă permeabilizarea mitocondrială în mod indirect prin declanșarea unor perturbări ale metabolismului intermediar sau prin creșterea concentrației de mesageri secundari proapoptotici, de exemplu, prin inducerea expresiei p53, prin inducerea căii ceramidelor/GD3, prin inducerea sistemului de liganzi CD95/CD95L, prin afectarea proteinelor de tip Bcl-2 și/sau prin compromiterea echilibrului redox sau energetic.

Există din ce în ce mai multe dovezi ale existenței unei legături încrucișate nucleo-mitochondriale în urma leziunilor ADN. De exemplu, semnalele apoptotice care decurg din leziuni ale ADN-ului pot fi transmise prin intermediul supresorului tumoral p53 către mitocondrii, care, la rândul lor, eliberează în citoplasmă factori apoptogeni care activează programele de distrugere din aval (Moll et al., 2005). p53 poate angaja indirect calea mitocondrială prin activarea transcripțională a expresiei proteinelor proapoptotice Bcl-2, de exemplu, Bid, Puma sau Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). În plus, p53 poate declanșa direct permeabilizarea membranei mitocondriale externe într-un mod independent de transcripție prin activarea directă a proteinelor Bcl-2 proapoptotice Bax sau Bak sau prin legarea și inactivarea proteinelor Bcl-2 antiapoptotice, cum ar fi Bcl-2 sau Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). În mod important, s-a demonstrat recent că p53, țintit mitocondrial, posedă activități supresoare de tumori și in vivo (Talos et al., 2005).

În plus, caspaza-2 posedă capacitatea de a angaja calea apoptotică mitocondrială ca răspuns la deteriorarea ADN prin permeabilizarea membranei mitocondriale externe și/sau prin ruperea asocierii citocromului c cu membrana mitocondrială internă. Prin urmare, celulele transfectate în mod stabil cu procaspaza-2 antisens sau care exprimă în mod tranzitoriu siRNA au fost refractare la eliberarea citocromului c și la diverse evenimente din aval, cum ar fi activarea caspazei și fragmentarea ADN-ului, induse de leziuni ale ADN-ului (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). Caspaza-2 poate acționa indirect asupra mitocondriilor, de exemplu, prin scindarea proteinei proapoptotice Bid, urmată de translocarea acesteia în mitocondrii pentru a induce eliberarea de citocrom c (Guo et al., 2002). În plus, caspaza-2 poate permeabiliza în mod direct membrana exterioară a mitocondriei și poate stimula eliberarea citocromului c și a Smac/DIABLO, posibil ca urmare a interacțiunii directe a caspazei-2 procesate cu proteinele presupuse și/sau fosfolipidele localizate în membrana mitocondrială exterioară sau la locurile de contact dintre membrana exterioară și cea interioară (Robertson et al., 2004). Permeabilizarea membranei mitocondriale externe necesită procesarea zimogenului caspazei-2, dar nu și a activității proteolitice asociate și are loc independent de mai multe proteine din familia Bcl-2, inclusiv Bax, Bak și Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Mai mult, s-a demonstrat, de asemenea, că caspaza-2 are capacitatea surprinzătoare de a întrerupe asocierea dintre citocromul c și fosfolipidele anionice, în special cardiolipina, ceea ce face ca citocromul c suplimentar să fie disponibil pentru a fi eliberat în citosol (Enoksson et al., 2004). În urma deteriorării ADN-ului, s-a raportat recent că caspaza-2 este activată în așa-numitul PIDDosom, un complex format din proteina PIDD care conține domeniul morții indus de p53, caspaza-2 și proteina adaptoare RAIDD (Tinel și Tschopp, 2004), ceea ce indică existența unei căi apoptotice nucleo-mitocondriale.

În plus, s-a raportat că histona H1.2 joacă un rol important în transmiterea semnalelor apoptotice de la nucleu la mitocondrii în urma rupturilor de dublu catenar de ADN (Konishi et al., 2003). Histona nucleară H1.2 este eliberată în citoplasmă printr-un mecanism dependent de p53 după ruperea dublă catenă de ADN și induce eliberarea de citocrom c din mitocondriile izolate într-o manieră dependentă de Bak (Konishi et al., 2003). Reducerea expresiei H1.2 a sporit rezistența celulară la apoptoza indusă de iradierea cu raze X sau de etopozid (Konishi et al., 2003).

Mai mult, receptorul nuclear orfan Nur77 (cunoscut și sub numele de TR3) a fost recent cuplat cu mașinăria apoptotică Bcl-2 la nivelul mitocondriilor (Lin et al., 2004). Legarea Nur77 la regiunea de buclă N-terminală a Bcl-2, situată între domeniile sale BH4 și BH3, induce o schimbare de conformație a Bcl-2 care expune domeniul său BH3, ceea ce duce la transformarea Bcl-2 din protector în ucigaș (Lin et al., 2004). În mod interesant, nivelurile ridicate ale unui membru al familiei Nur77 au fost asociate cu răspunsuri favorabile la agenții chimioterapici la pacienți (Shipp et al., 2002).

În plus, la stresul celular, inclusiv la medicamente chimioterapeutice, membrii specifici proapoptotici ai familiei Bcl-2 sunt activați, depresați sau induși și, astfel, acționează ca senzori. Activitatea proteinelor BH3-only este ținută sub control prin mai multe mecanisme, menținând aceste proteine departe de omologii Bcl-2 multidomeniu în condiții normale, dar permițând activarea lor rapidă în condiții de stres (Bouillet și Strasser, 2002). După cum s-a menționat mai sus, proteinele din familia Bcl-2, cum ar fi Bid, Puma sau Noxa, se află sub controlul transcripțional al supresorului de tumori p53 și, prin urmare, sunt suprareglementate ca răspuns la agenții care dăunează ADN-ului (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Proteina Bim, care conține numai BH3 și care este asociată cu citoscheletul prin legarea la microtubuli, este eliberată și activează calea intrinsecă în urma tratamentului cu taxol, care acționează asupra asamblării microtubulilor (Sunters et al., 2003). Recent, s-a demonstrat că paclitaxelul induce acumularea Bim și apoptoza dependentă de Bim în tumorile epiteliale in vitro și, de asemenea, in vivo (Tan et al., 2005). Proteinele BH3-only active se leagă și contracarează membrii antiapoptotici și, în unele cazuri, activează membrii multidomeniu proapoptotici ai familiei Bcl-2, ceea ce duce la pierderea permeabilității membranei mitocondriale (Bouillet și Strasser, 2002). Modul în care proteinele Bcl-2 induc perturbarea membranei exterioare mitocondriale este încă subiect de dezbatere și poate implica capacitatea de formare a porilor și de auto-oligomerizare a unor proteine din familia Bcl-2, modularea porului de tranziție de permeabilitate mitocondrială de către proteinele din familia Bcl-2 și/sau modificări lipidice și interacțiuni între proteinele lipidice din cadrul membranelor mitocondriale. Mai mult, agenții chimioterapeutici, cum ar fi paclitaxelul, determină hiperfosforilarea și inactivarea Bcl-2 și, simultan, favorizează deschiderea porului de tranziție de permeabilitate (PT) (Ruvolo et al., 2001).

Medicamentele chimioterapeutice pot, de asemenea, să inducă sau să faciliteze permeabilizarea membranei mitocondriale externe prin modificări ale potențialelor redox celulare datorate unei generări sporite de specii reactive de oxigen (sau unei scăderi a detoxifierii acestora), epuizării glutationului redus sau epuizării NADPH, deoarece megacanalul mitocondrial posedă mai multe situsuri sensibile la redox (Debatin et al., 2002). În plus, modificările metabolismului energetic, de exemplu epuizarea ADP și ATP, ar putea facilita deschiderea complexului de pori de tranziție a permeabilității (PTPC), deoarece ADP și ATP sunt liganzii fiziologici ai translocatorului de nucleotide de adenină, care funcționează ca inhibitori endogeni ai PTPC (Costantini et al., 2000). De asemenea, decuplarea sau inhibarea lanțului respirator sau alcalinizarea matricei poate favoriza permeabilizarea membranei mitocondriale. În plus, mesagerii lipidici, cum ar fi ceramida, care este generată în celulele expuse la mai mulți stimuli care induc apoptoza, inclusiv medicamente citotoxice, pot contribui la permeabilizarea membranei mitocondriale (Susin et al., 1997). La concentrații ridicate. unele medicamente chimioterapeutice, de exemplu, etopozidul sau paclitaxelul, pot, de asemenea, să inducă permeabilizarea membranei exterioare mitocondriale în mitocondrii izolate (Robertson și colab., 2000; Kidd și colab, 2002).

În plus, s-a demonstrat că un număr tot mai mare de medicamente anticancerigene experimentale, inclusiv arsenitul, lonidamida, retinoidul sintetic CD437 sau produsul natural acidul betulinic, acționează direct asupra mitocondriilor (Debatin et al., 2002). De exemplu, s-a raportat că acidul betulinic declanșează apoptoza prin inducerea directă a pierderii potențialului de membrană mitocondrială în mitocondrii izolate, într-un mod care nu este afectat de inhibitorul de caspază Z-VAD-fmk și totuși este inhibat de BA, un inhibitor al PTPC, sau de Bcl-2 și Bcl-XL (Fulda et al, 1998b).

Strategii care vizează calea intrinsecă

Proteine din familia Bcl-2

Din moment ce proteinele antiapoptotice Bcl-2, care blochează puternic calea intrinsecă de apoptoză, se găsesc la niveluri ridicate în cancerele umane atât de origine hematologică, cât și nonhematologică (Cotter, 2004), acestea reprezintă ținte promițătoare pentru intervenții terapeutice. În consecință, au fost dezvoltate mai multe strategii pentru a viza proteinele Bcl-2, de exemplu, tehnici antisens, peptide cu domeniu BH3 sau medicamente sintetice cu molecule mici care interferează cu funcția proteinei de tip Bcl-2. Pentru a downregla expresia Bcl-2, oligonucleotide antisens Bcl-2 (genasense) au fost dezvoltate de Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, SUA). Genasense este un oligonucleotid sintetic, de 18 baze, monocatenar fosforotiodat, care țintește selectiv primii șase codoni (adică 18 baze) din cadrul de citire deschis al ARNm care codifică proteina Bcl-2 (Cotter, 2004). Tratamentul cu genasens a sporit în mod semnificativ activitatea antitumorală a multor medicamente chimioterapeutice, de exemplu, taxani, antracicline, alchilatori sau agenți care conțin platină (Cotter, 2004). Într-un model preclinic de melanom, pretratarea cu genasens a crescut sensibilitatea la chimioterapie a melanomului uman (Jansen et al., 1998). De asemenea, într-un studiu clinic, s-a raportat că genasense acționează ca chimiosensibilizator pentru dacarbazină la pacienții cu melanom malign (Jansen et al., 2000). Pentru a optimiza terapia bazată pe antisens, au fost proiectate ulterior oligonucleotide antisens bispecifice îndreptate împotriva unei secvențe foarte omoloage în Bcl-2 și Bcl-xL, dar care lipsește în ARNm Bcl-xS (Zangemeister-Wittke și colab., 2000). Scăderea simultană atât a lui Bcl-2, cât și a lui Bcl-xL a indus apoptoza și a sporit chimiosensibilitatea în diferite celule canceroase (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

În plus, au fost dezvoltate peptide cu domeniu BH3 sau inhibitori sintetici cu molecule mici pentru a ținti proteinele antiapoptotice de tip Bcl-2. Domeniul BH3 cuprinde un α-helix amfifatic de nouă aminoacizi care se leagă de un buzunar hidrofob al proteinelor de tip Bcl-2 (Cory și Adams, 2002). În mod similar, peptidele din domeniul BH3 au ca scop întreruperea acestui complex, sensibilizând astfel celulele canceroase la apoptoză (Letai et al., 2002). În plus, înlocuirea domeniului BH3 Bid cu aminoacizi nenaturali pe suprafața opusă regiunii de interacțiune prin capsare hidrocarbonată a dus la peptide BH3 stabilizate denumite SAHB (stabilized α-helix of Bcl-2 domains), cu proprietăți farmacologice îmbunătățite (Walensky et al., 2004). Aceste peptide BH3 stabilizate au declanșat apoptoza într-o varietate de linii celulare leucemice și au inhibat, de asemenea, creșterea xenogrefele de leucemie la șoareci fără efecte secundare adverse (Walensky et al., 2004).

De asemenea, au fost identificați mai mulți compuși cu molecule mici care interferează cu funcția Bcl-2/Bcl-xL. Screening-ul unei biblioteci chimice pentru compuși capabili să se lege de buzunarul BH3 al proteinelor Bcl-2 a dus la identificarea HA14-1, un compus care concurează cu Bak pentru legarea la Bcl-2 (Wang et al., 2000). Prin depistarea unei biblioteci de 16 320 de compuși preselectați pentru capacitatea de a deplasa o peptidă fluorescentă Bak BH3 de la Bcl-xL într-un test de polarizare fluorescentă, Degterev și colab. (2003) au identificat două clase de agenți numiți inhibitori BH3 (BH3I), care perturbă, de asemenea, complexul Bcl-xL cu Bax și Bad în celule intacte.

Utilizând screening-ul bazat pe rezonanța magnetică nucleară (RMN), sinteza paralelă și proiectarea bazată pe structură, a fost descoperit recent un inhibitor cu moleculă mică al proteinelor antiapoptotice Bcl-2, Bcl-X(L) și Bcl-w, ABT-737. ABT-737 a fost eficient ca agent unic împotriva anumitor limfoame și tumori solide și a prezentat citotoxicitate sinergică cu chimioterapicele și radiațiile (Oltersdorf et al., 2005).

Agoniști Smac/DIABLO

Pentru proiectarea unor molecule mici potențial terapeutice care să vizeze XIAP, canelura de legare a domeniului BIR3 al XIAP, de care se leagă Smac/DIABLO după eliberarea sa din mitocondrii, a atras cea mai mare atenție. Analiza structurală a oferit o justificare clară pentru sinteza unor compuși mici care pot imita activitatea de dislocare a caspazei-9 a Smac/DIABLO din BIR3 al XIAP (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). Pentru a spori livrarea intracelulară, peptidele Smac au fost legate de un purtător, de exemplu, de motivul de transducție proteică al proteinei HIV Tat (Fulda et al., 2002), de secvența penetratină antennapaedia Drosophila (Arnt et al., 2002) sau de o întindere de poliarginină (Yang et al., 2003b). S-a raportat că o heptapeptidă care reprezintă extremitatea N-terminală a Smac/DIABLO matură, care este esențială pentru legarea la XIAP, promovează activarea caspazei și sensibilizează diverse linii celulare tumorale și, de asemenea, celulele tumorale primare derivate de la pacienți la apoptoza indusă de ligatura receptorilor de moarte sau de medicamente citotoxice (Fulda et al., 2002). Este important faptul că peptidele Smac au îmbunătățit chiar și activitatea antitumorală a TRAIL in vivo într-un model de xenogrefă de gliom malign intracranian (Fulda și colab., 2002b). De asemenea, o peptidă de 8 meri (AVPIAQKS) fuzionată cu domeniul de transducție proteică al penetratinei antennapaedia din Drosophila a fost capabilă să pătrundă în celulele canceroase mamare, să se lege de XIAP și cIAP1 și să potențeze activitatea caspazei indusă de o serie de medicamente anticancerigene, inclusiv paclitaxel, etoposid, 7-etil-10-hidroxiacamptotecină (SN-38) și doxorubicină (Arnt et al., 2002). Mai mult, pe baza structurii tridimensionale a Smac/DIABLO în complex cu XIAP BIR3, au fost concepute peptidomimetice Smac, care au cooperat cu TRAIL, TNFα, cisplatin sau etoposid pentru a declanșa apoptoza în celulele tumorale (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Ulterior, au fost dezvoltați antagoniști moleculari mici non-peptidici ai XIAP, care au fost obținuți prin screening-ul unei biblioteci de fagi sau a unei biblioteci de polifeniluree, pentru a ținti IAPs (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). În plus, produsul natural embelin din planta japoneză Ardisia a fost descoperit recent ca un inhibitor al XIAP permeabil la celule, nepeptidic, cu greutate moleculară mică, prin screening-ul computațional bazat pe structură al unei baze de date de structuri tridimensionale a plantelor medicinale tradiționale (Nikolovska-Coleska et al., 2004). S-a demonstrat că Embelin depășește în mod eficient efectul protector al XIAP în celulele canceroase de prostată cu niveluri endogene ridicate de XIAP sau în celulele Jurkat transfectate cu XIAP prin legarea la domeniul BIR3 al XIAP (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Astfel, agoniștii Smac sau antagoniștii XIAP cu greutate moleculară mică pot fi candidați promițători pentru terapia cancerului prin potențarea eficacității terapiilor citotoxice în mod selectiv în celulele canceroase.

.