Conversia enzimatică a ARNm în inserție de ADN bicatenar poate fi realizată printr-un număr de proceduri diferite. Toate acestea implică acțiunea transcriptazei inverse și sinteza de ADNc inițiată de oligonucleotide. După aceea, procedurile utilizate în mod obișnuit diferă considerabil. Există o serie de metode de sintetizare a celui de-al doilea catenar și mai multe proceduri de producere a capetelor adecvate pentru realizarea de ADN clonabil. Scopurile principale ale acestor proceduri sunt construirea unui insert de ADN cât mai lung posibil, cu un randament ridicat de conversie a ARNm în ADN care se poate lega la un vector ADN. Următoarele protocoale necesită doar reactivi disponibili în comerț ș i reuș esc, de obicei, să producă biblioteci bune de ADNc. Protocolul de bază descrie o metodă de obținere a ADNc cu terminația blunt-ended, care poate fi apoi ligat la linkeri pentru clonarea ulterioară într-un situs de restricție unic, cum ar fi EcoRI. Protocolul alternativ este o variantă care necesită mai puține manipulări enzimatice și permite construirea de biblioteci de ADNc direcționale, care sunt de dorit în special atunci când scopul este de a genera biblioteci de ADNc de expresie. Protocolul alternativ profită de un primer de legătură format din (în ordine de la 3′ la 5′) un primer oligo(dT), un situs de restricție pentru endonucleaza XhoI și o repetiție (GA)20 pentru a proteja situsul de restricție în timpul generării ADNc cu capătul blunt-ended. Siturile XhoI interne de pe moleculele individuale de ADNc sunt protejate prin încorporarea de 5-metil-dCTP în amestecul de nucleotide din primul șir. ADNc rezultat, care are capete unice, poate fi clonat în vectori EcoRI /XhoI -digestionați după ligarea adaptorilor EcoRI la capătul 5′ și digestia cu XhoI pentru a elibera situsurile XhoI 3′ care au fost încorporate în ADNc de către linker-primer. Aceste modificări au ca rezultat o procedură considerabil raționalizată care este substanțial mai rapidă și mai ușoară decât protocolul de bază.
.