Elucidarea rolului funcțional al Mycobacterium smegmatis recX în răspunsul la stres

Hipoxia determină o creștere a expresiei de M. smegmatis recA și recX

În cursul infecției și al proliferării, M. tuberculosis este expus la condiții fiziologice de stres, cum ar fi hipoxia și stresul pH-ului acid, care ar putea compromite supraviețuirea sa38,39,40. De exemplu, stresul hipoxic acut oprește replicarea ADN-ului și declanșează leziuni robuste ale ADN-ului41,42,43. O creștere a expresiei genelor din calea SOS, inclusiv umuDC, polB, recN, sulA, uvrA, uvrB și uvrD, începe la deteriorarea ADN44,45,46. În acest scop, profilarea expresiei genelor induse de hipoxie la M. smegmatis și M. tuberculosis în timpul infecției latente a oferit informații valoroase privind natura bacilului tuberculos latent și tratamentul acestuia47.

Studii anterioare la M. tuberculosis48, Thiobacillus ferrooxidans49 și Streptomyces lividans50 au demonstrat că recA este co-transcrisă cu recX. Mai mult, s-a constatat că o supraexpresie a RecA (un regulator pozitiv al răspunsului SOS) este toxică în absența RecX la anumite specii bacteriene, inclusiv Pseudomonas aeruginosa51, S. lividans50, M. smegmatis52 și Xanthomonas oryzae53. Aceste constatări sunt în concordanță cu ideea că RecX acționează ca o antirecombinază pentru a înăbuși evenimentele de recombinare necorespunzătoare promovate de RecA14. În schimb, o supraexprimare a RecA în tulpina E. coli ΔrecX nu este dăunătoare, iar suprimarea RecX nu afectează expresia RecA54. Transcripția recX în E. coli este reglată în jos în comparație cu recA în condiții normale de creștere, din cauza existenței unui situs de terminare a transcripției între secvențele de codificare recA și recX. Cu toate acestea, o transcripție de ARNm recA-recX rezultată din read-through transcripțional se acumulează în intervalul de 5-10% din conținutul total de ARNm recA54. Transcriptul recX a fost greu detectabil în timpul creșterii vegetative a E. coli, dar o expresie robustă a recX apare în urma tratamentului cu agenți de deteriorare a ADN-ului15,55.

Genomurile atât ale M. smegmatis, cât și ale M. tuberculosis conțin câte o singură copie a recA și recX într-un singur operon. Pentru a investiga expresia și reglarea acestor gene în condiții de creștere aerobă și hipoxică la M. smegmatis, un model de substituție utilizat în mod obișnuit pentru M. tuberculosis, abundența relativă a ARNm în diferite faze de creștere a fost măsurată printr-un test RT-qPCR și normalizată în raport cu cea a genei ARNr 16S exprimată constitutiv. Valorile pragului de ciclu (Ct) pentru ARNm recA și recX din M. smegmatis au fost normalizate în raport cu valoarea Ct a genei 16S ARNr. Spre deosebire de E. coli15,55, o cantitate semnificativă de transcripții de ARNm recA a fost observată la începutul fazei log timpuriu atât în condiții de cultură aerobă, cât și în condiții hipoxice (Fig. 1A). În mod interesant, condițiile hipoxice au sporit acumularea de ARNm recA de 1,5 ori la jumătatea fazei-log și au scăzut ulterior, pe măsură ce celulele au intrat în faza staționară. Un model similar a fost observat cu abundența ARNm recX atât în condiții aerobe, cât și în condiții hipoxice, deși la niveluri reduse (Fig. 1B). Aceste observații susțin ideea că cele două gene sunt co-transcrise și reglementate în mod coordonat în condiții de creștere aerobă și hipoxică. În mod curios, nu s-a observat nicio diferență în ceea ce privește cantitățile de ARNm în condiții de creștere aerobă și hipoxică în faza inițială de logaritmie. Profilurile transcripționale ale genelor marker specifice fazei de creștere a M. smegmatis (sigH2 și sigH7)56 au fost utilizate pentru a determina momentele fazelor early-log, mid-log și staționară (Fig. 1C). În cazul tulpinilor clinice de M. tuberculosis rezistente la mai multe medicamente, s-a constatat că nivelurile ARNm recA și recX sunt mai ridicate decât în cazul tulpinilor sensibile la medicamente, iar nivelurile ARNm recX au crescut concomitent cu o creștere a ARNm recA57.

Totuși, trebuie remarcat faptul că nivelurile de ARNm nu pot fi utilizate ca surogate pentru nivelurile de proteine corespunzătoare. Prin urmare, abundența proteinelor RecA și RecX în M. smegmatis a fost măsurată în condiții aerobe și hipoxice printr-un test Western blot folosind anticorpi anti-RecA și anti-RecX. GroEL a fost testat ca martor de încărcare proteică. Analiza densitometrică a imunobloturilor a arătat că celulele au acumulat niveluri mai mari de RecA în condiții de creștere hipoxică în comparație cu condițiile aerobe (Fig. 2A,B). O analiză comparativă a arătat că celulele au acumulat în mod constant niveluri de 2 ori mai mari de RecA în fazele de log mediu față de faza de log timpuriu în condiții de creștere aerobă, care au scăzut în faza staționară la nivelurile observate în faza de log timpuriu (Fig. 2A,B). Un model similar a fost observat pentru RecX, deși nivelurile au fost mai puțin pronunțate decât cele ale RecA (Fig. 2A,C). Deși modelele de exprimare a ARNm și a proteinelor au fost comparabile, s-au observat diferențe importante. În primul rând, proteina RecX a fost cu greu detectabilă în faza inițială de logaritmie în condiții hipoxice. În al doilea rând, abundența ARNm și a proteinei RecA a fost mai mare în comparație cu RecX.

Deși, aceste rezultate sugerează că genele recA și recX ale M. smegmatis sunt induse în condiții hipoxice, nu există o corelație între cantitatea de ARNm recX și proteina corespunzătoare în faza de log timpurie. S-a demonstrat că atât M. tuberculosis, cât și M. smegmatis își stabilizează transcripțiile ARNm în condiții de inhibare a creșterii58,59,60. Printre mecanismele posibile, s-a demonstrat că reprogramarea ARNt și traducerea selectivă în funcție de codon joacă un rol la micobacterii ca răspuns la hipoxie61. O posibilă explicație a lipsei de corelație între nivelul de ARNm recX și cel al proteinelor în faza logaritmică timpurie s-ar putea datora reprimării translaționale a ARNm recX.

Construcția tulpinilor mutante ΔrecX și ΔrecA ΔrecX

Diferența dintre nivelurile proteinelor RecA și RecX la M. smegmatis indică o posibilă reglare a expresiei genice la nivelul transcripției. La multe bacterii studiate până în prezent, gena recX este localizată pe același lanț codificator în aval de recA, iar cele două gene sunt co-transcrise48,50,53,53,54,62,63. Cu toate acestea, în locusul lexA-recA-recX din Xanthomonas pathovars, fiecare genă este exprimată de propriul promotor64. Mai mult, la D. radiodurans65,66, B. subtilis67 și N. gonorrhoeae26, genele recA și recX sunt separate de câteva sute de kb în lungime și sunt transcrise de promotori proprii.

Într-un număr de specii de micobacterii, precum și la alte câteva bacterii, regiunea 5′ a secvenței de codificare recX se suprapune peste regiunea 3′ a genei recA. Suprapunerea are o lungime de 32 pb la M. smegmatis48, în timp ce la M. tuberculosis68 și M. leprae69 suprapunerea este de 35 pb. Efectul deleției recX asupra caracteristicilor fenotipice a fost studiat la diferite organisme7,10. Mutanții knock-out ai recX prezintă o serie de fenotipuri asociate cu funcțiile RecA: inactivarea recX din B. subtilis a făcut ca celulele să devină sensibile la MMS și H2O225, mutanții recX din S. lividans au prezentat o rezistență scăzută la deteriorarea UV42 , iar mutantul recX din N. gonorrhoeae a prezentat o mică scădere a capacității sale de a supraviețui la deteriorarea ADN-ului care a fost cauzată de rupturi de catenă dublă26. Cu toate acestea, impactul deleției atât a genei recA, cât și a genei recX asupra caracteristicilor de creștere și a reparării leziunilor ADN nu a fost investigat la niciun organism. Mai mult, nu se înțelege pe deplin rolul in vivo al genei recX la micobacterii.

Studii anterioare au demonstrat că tulpina M. smegmatis ΔrecA a prezentat sensibilitate la leziunile ADN induse de UV și nu reușește să promoveze HR52. Am combinat mutația recA cu deleția lui recX pentru a investiga efectele mutațiilor duble. În acest scop, au fost generate tulpini de M. smegmatis mc2155 recX simple și duble mutante recArecX. Ca martor, efectul deleției recA în M. smegmatis a fost reevaluat pentru o comparație directă. Utilizând metoda de recombinare, care se bazează pe un protocol dezvoltat pentru M. tuberculosis și M. bovis BCG28, mutanții M. smegmatis mc2155 ΔrecA și ΔrecAΔrecX au fost generați folosind construcții AES liniare ΔrecA::hyg și, respectiv, ΔrecAΔrecX::hyg de 3,279 kb și 3,302 kb. Aproximativ 100 ng de fragmente de ADN AES liniar au fost generate prin digestia de restricție a plasmidelor respective cu EcoRV (Fig. 3A). Acestea au fost transformate în celule competente de recombinare M. smegmatis mc2155:pJV5370. După 4-5 zile de incubare, s-au găsit 8-10 colonii rezistente la Hyg pentru mutanții ΔrecX și ΔrecAΔrecX. Tulpinile mutante putative au fost analizate cu ajutorul PCR pentru a determina dacă genele recX și recArecX au fost eliminate din cromozom (datele nu sunt prezentate). Mutanții corecți au fost crescuți în mediu de agar Middlebrook 7H10 timp de 5-8 generații pentru a permite pierderea pJV53.

Analiză genotipică și fenotipică a tulpinii M. smegmatis ΔrecX și ΔrecAΔrecX mutanți

După depistarea prin PCR, s-au obținut câte 2 mutanți knockout ΔrecX și ΔrecAΔrecX din M. smegmatis mc2155. Mutanții ΔrecX și ΔrecAΔrecX au fost caracterizați prin cartografiere cu enzime de restricție și hibridizare Southern blot (Fig. 3). În urma hibridizării cu sonde radiomarcate corespunzătoare, s-a observat un fragment de 4,1 kb în cazul celulelor M. smegmatis mc2155 de tip sălbatic. Fragmentele prezise de 3,14 kb și 2,09 kb au fost observate în cazul mutanților ΔrecX și, respectiv, ΔrecAΔrecX (Fig. 3B,C). Ambele aceste benzi sunt mai mici de 4,1 kb, ceea ce indică faptul că genele recX și recArecX au fost eliminate prin înlocuire alelică. Frecvența schimbului alelic în ceea ce privește recX și recArecX a fost de 70 % și, respectiv, 80 %.

Un avertisment al acestei analize este că efectele observate ale mutațiilor ΔrecX și ΔrecAΔrecX ar putea rezulta din efectele polare ale inserției genei de rezistență la higromicină. În general, alterările genetice din jurul locusului recA-recX ar putea duce la efecte polare asupra expresiei genelor din aval de locusul recA-recX. S-au efectuat două experimente independente pentru a investiga potențialele efecte polare. În primul rând, mutanții ΔrecX și ΔrecAΔrecX au fost completați cu copii funcționale ale genelor recA și recX. Transformanții au fost evaluați pentru capacitatea lor de a crește într-un mediu de cultură standard și de a proteja celulele mutante împotriva iradierii UV. Diluții în serie de zece ori au fost punctate pe plăci de agar 7H10 și analizate. După cum se arată în Fig. 4A,B, recA de tip sălbatic a completat parțial tulpinile mutante ΔrecA și ΔrecAΔrecX, după cum se deduce din capacitatea lor de a susține creșterea și de a oferi protecție împotriva iradierii UV. Cu toate acestea, recX de tip sălbatic nu a reușit să salveze fenotipul tulpinilor mutante ΔrecAΔrecX observat la inducerea de leziuni ale ADN-ului cu iradiere UV. Deoarece deleția lui recX nu a avut niciun efect vizibil asupra creșterii sale în condiții normale și în condiții de deteriorare a ADN-ului, ΔrecX și tulpina completată corespunzătoare au prezentat o creștere similară cu cea a tipului sălbatic.

În al doilea rând, am evaluat expresia a două gene M. smegmatis mc2155 genele gluD (MSMEG_2725) și glnH (MSMEG_2726), situate în urma locusului recA recX în tulpinile mutante ΔrecA ΔrecX și ΔrecX în comparație cu tulpina de tip sălbatic. Gena M. smegmatis hyd2 (MSMEG_2720) situată în amonte de locusul recA-recX a fost utilizată ca un control pozitiv. ARN-ul total a fost preparat din tulpinile de tip sălbatic, din tulpinile mutante ΔrecA ΔrecX și ΔrecX. Abundența relativă a transcriptelor genelor a fost determinată prin RT-qPCR cantitativă și normalizată în raport cu cea a genei 16S ARNr cromozomiale exprimate în mod constitutiv. Nivelurile de expresie au fost măsurate din celule crescute în faza de creștere exponențială târzie. În toate cazurile, profilurile de expresie genetică ale ORF-urilor din amonte și din aval au fost similare pentru tulpinile de tip sălbatic și cele mutante (Fig. 4C). Luate împreună, aceste rezultate exclud posibilitatea ca inserția genei de rezistență la higromicină să cauzeze efecte polare.

Strenele mutante M. smegmatis ΔrecA și ΔrecA ΔrecX prezintă o creștere deficitară și un randament celular redus în raport cu tulpina de tip sălbatic

Pentru a caracteriza tulpinile mutante M. smegmatis ΔrecA și ΔrecA ΔrecX smegmatis ΔrecX și tulpinile mutante ΔrecA ΔrecX, profilurile de creștere ale tulpinilor de tip sălbatic și ale tulpinilor knock-out au fost măsurate în bulionul 7H9 Middlebrook la 37 °C (Fig. 5). Eliminarea recX nu a avut niciun efect vizibil (în comparație cu tulpina de tip sălbatic) asupra creșterii lui M. smegmatis. În condiții similare, deleția recA a crescut în mod semnificativ durata fazei de întârziere și a redus concomitent faza de creștere exponențială, sugerând că recA joacă un rol în creșterea și viabilitatea M. smegmatis. În plus, aceste rezultate sunt în concordanță cu funcția cunoscută a RecA în salvarea furcilor de replicare blocate sau colapsate71,72,73. Deoarece genele recA și recX formează un singur operon, s-a investigat impactul eliminării lor asupra creșterii M. smegmatis. Tulpina ΔrecA ΔrecX knock-out a prezentat un fenotip de creștere care a fost intermediar între mutantul ΔrecA și tulpina de tip sălbatic; cu toate acestea, creșterea în fazele logaritmice târzii și staționare a fost similară cu cea a tulpinilor ΔrecA și de tip sălbatic.

Deleția lui RecA, dar nu și a lui RecX, face ca M. smegmatis să fie mai sensibil la agenții de deteriorare a ADN-ului

Similară altor eubacterii, proteina RecA micobacteriană joacă un rol crucial în reglarea răspunsului SOS în cazul deteriorării ADN-ului74,75,76,77. Pentru a testa dacă absența recArecX și recX afectează capacitatea M. smegmatis de a repara eficient ADN-ul deteriorat, mutanții au fost expuși la o serie de agenți cu mecanisme variate de deteriorare a ADN-ului. În aceste experimente, stresul a fost indus prin expunerea tulpinilor mutante ΔrecA, ΔrecX și ΔrecA ΔrecX la iradiere UV, MMS, H2O2 sau ciprofloxacină în timpul fazei exponențiale (OD600 de 0,6) a creșterii bacteriene. După 3 ore de incubație, celulele au fost spălate și viabilitatea lor a fost evaluată prin colorarea unor diluții în serie de zece ori a culturilor pe plăci de agar Middlebrook 7H10 care conțin higromicină (100 µg/ml). Cea mai adecvată concentrație/doză de agenți de deteriorare a ADN-ului a fost determinată după evaluarea diferențelor de viabilitate celulară dintre tulpini cu ajutorul testelor pe placă. În absența agenților de deteriorare a ADN-ului, toate tulpinile au prezentat niveluri similare de viabilitate celulară (Fig. 6). În schimb, în prezența agenților de deteriorare a ADN-ului, tulpina ΔrecA a prezentat un defect de creștere pronunțat, însoțit de o scădere de 100 de ori a eficienței de însămânțare în raport cu tulpina de tip sălbatic. Acest fenotip este în concordanță cu literatura de specialitate disponibilă. În schimb, efectul letal al UV, MMS sau al ciprofloxacinei, dar nu și al H2O2, a fost parțial blocat prin deleția genei recX în tulpina ΔrecA. Deși baza lipsei efectului H2O2 nu este clară, concentrația utilizată nu a fost probabil suficient de mare pentru a afecta creșterea. Este interesant faptul că tulpina ΔrecX a prezentat un fenotip ușor mai rezistent la toți cei patru agenți de deteriorare a ADN-ului decât tulpina ΔrecA ΔrecX, ceea ce indică un posibil câștig de funcție datorat pierderii genei recX. Având în vedere aceste rezultate, este evident că recA joacă un rol activ în răspunsul SOS și că sensibilitatea la agenții de deteriorare a ADN-ului este ușor suprimată în tulpina ΔrecX.

Supraviețuirea după tratamentul cu diferite concentrații de agenți de deteriorare a ADN-ului

Micobacteriile se confruntă cu o serie de condiții de stres advers, cum ar fi stresul oxidativ, nutrițional și indus de medicamente78,79,80,81,82. Pentru a explora în continuare diferențele de viabilitate celulară, au fost efectuate experimente în care viabilitatea celulară a fost măsurată prin unități formatoare de colonii (CFU). În primul rând, viabilitatea mutanților M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX și ΔrecAΔrecX a fost testată în comparație cu cea a mutanților de tip sălbatic prin provocarea acestora cu concentrații crescânde de MMS. Tulpinile au fost cultivate în prezența concentrațiilor indicate de MMS, până când culturile au atins o DO600 de 0,6. Viabilitatea celulară a fost testată prin însămânțarea unui număr predeterminat de celule pe plăci de agar 7H10. Celulele au fost considerate vii dacă au fost capabile să se dividă și să formeze colonii. Spre deosebire de tulpina de tip sălbatic, mutanții au prezentat o sensibilitate crescută la MMS în funcție de concentrație. Analiza cantitativă a indicat că mutantul ΔrecA a prezentat o sensibilitate relativ mai mare la MMS, care a crescut odată cu creșterea concentrațiilor de MMS (Fig. 7A). În cazul ΔrecX, celulele au fost de ~2 ori mai puțin sensibile la MMS în comparație cu celulele ΔrecA. Pe de altă parte, mutantul ΔrecA ΔrecX a prezentat o sensibilitate mai mare la MMS, spre deosebire de mutantul ΔrecX. Sensibilitatea mutantului ΔrecX la MMS indică faptul că recX ar putea avea ținte încă neidentificate în plus față de RecA. Această ipoteză necesită investigații suplimentare.

În continuare, au fost analizate sensibilitățile M. smegmatis mc2155 ΔrecA, ΔrecX și tulpinile mutante ΔrecA ΔrecX în raport cu tulpina de tip sălbatic au fost determinate prin expunerea acestora la concentrații crescânde de H2O2. Rezultatele arată că mutanta ΔrecA a fost mai puțin sensibilă la acest tratament (Fig. 7B). Eliminarea recX singur, sau eliminarea locusului recA-recX, a avut doar un efect minor asupra viabilității și proliferării celulelor mutante ca răspuns la tratamentul cu H2O2. În special, tulpinile mutante ΔrecA și ΔrecAΔrecX au prezentat un fenotip de creștere sensibil la iradierea UV și la ciprofloxacină, care este semnificativ mult mai sever decât la MMS sau H2O2 (Fig. 7C,D). Mai mult, tulpina ΔrecA a prezentat o sensibilitate mai mare la iradierea UV și la ciprofloxacină decât tulpina mutantă dublă ΔrecA ΔrecX.

Expresia genelor recA și recX este indusă de leziuni ale ADN-ului

Elementele de reglare în amonte de gena recA nu sunt conservate în toate speciile de micobacterii. De exemplu, gena recA din M. tuberculosis este transcrisă de doi promotori: ambii sunt inductibili prin deteriorarea ADN-ului, deși prin mecanisme diferite. Promotorul P1 al genei recA din M. tuberculosis (proximal față de codonul de start) poate fi indus în urma deteriorării ADN-ului independent de proteinele LexA și RecA. În schimb, promotorul P2 (situat la distanță de codonul de pornire recA) este reglat de LexA, care este analog din punct de vedere funcțional cu promotorul recA din E. coli83,84,85. Este interesant faptul că mecanismul de inducere a deteriorării ADN în M. tuberculosis nu este complet conservat în M. smegmatis46,75. Aceste constatări subliniază necesitatea de a înțelege expresia și reglarea genelor recA și recX din M. smegmatis și rolurile acestora ca răspuns la agenții de deteriorare a ADN.

După cum a fost descris mai sus, hipoxia a determinat o creștere a expresiei genelor recA și recX din M. smegmatis (Fig. 1). Pentru a corobora și mai mult ideea că expresia genelor recA și recX ale M. smegmatis este inductibilă la daune, s-a determinat cinetica inducerii cu și fără daune ale ADN-ului cu ajutorul RT-qPCR. S-au preparat probe de ARN total din celule de M. smegmatis recoltate la 0, 3, 6, 9 și 12 ore după expunerea la lumină UV, precum și din culturi netratate și au fost analizate conform descrierii din secțiunea „Metode”. Rezultatele nu au evidențiat diferențe semnificative între nivelurile de transcripție recA și recX în celulele netratate. În schimb, s-a observat o creștere accentuată a transcriptelor ARNm recA și recX la 3 ore după expunerea la radiații UV, după care a scăzut ușor. O comparație a datelor RT-qPCR indică diferențe importante între nivelurile transcriptelor recA și recX. Expunerea la radiații UV a dus la o creștere de ~8 ori a ARNm recA față de control, în timp ce recX de ~3 ori (Fig. 8A,B). Astfel, deși ARNm recA și recX există în aceeași unitate transcripțională, aceste rezultate susțin ideea că producția și/sau stabilitatea transcripției ARNm recX este supusă unui mecanism suplimentar de reglementare posttranscripțională.

Aceste rezultate ne-au determinat să efectuăm experimente suplimentare pentru a determina cinetica acumulării proteinelor RecA și RecX în celulele M. smegmatis cu sau fără leziuni ale ADN-ului. S-au efectuat teste de Western blotting pe lizate de celule întregi utilizând anticorpi policlonali crescuți împotriva RecA și RecX (Fig. 8C). Cuantificarea Western blot-urilor a arătat că celulele conțin cantități semnificative de proteine RecA și RecX atât în celulele neinduse (Fig. 8D,E). Prin comparație, o creștere de 2 ori a abundenței atât a RecA, cât și a RecX (față de control) a fost observată în celule la 3 h după expunerea la radiații UV și a scăzut după aceea. Este important faptul că inducerea proteinelor RecA și RecX a prezentat un model care amintește de cel observat în celulele aflate în condiții hipoxice (Fig. 2), deși mecanismele prin care acestea deteriorează ADN-ul sunt probabil diferite.

Observații finale

Numeroase studii au demonstrat că recA și recX îndeplinesc o gamă largă de funcții legate de repararea și recombinarea ADN-ului7,10. După cunoștințele noastre, nu au fost identificați stimulii care activează expresia genelor recA și recX din M. smegmatis. În acest studiu, nivelurile de expresie ale acestor gene au fost evaluate în celulele aflate în creștere aerobă și ca răspuns la diferite condiții de stres. La M. smegmatis, similar cu multe specii bacteriene, recA și recX aparțin aceluiași operon, iar gena recX este situată imediat în aval de gena recA și împart regiuni de codificare suprapuse86. S-a constatat că agenții de deteriorare a ADN-ului au indus expresia ambelor gene în proporții diferite; cu toate acestea, ratele de expresie urmează un model similar. În mod interesant, nivelurile atât ale RecA, cât și ale RecX rămân ridicate în condiții de stres comparativ cu condițiile de creștere aerobă.

Diverse studii au demonstrat roluri alternative pentru recX în repararea ADN-ului prin recombinare promovată de RecA. În timp ce proteina RecX interacționează fizic cu RecA și funcționează ca un inhibitor puternic al tuturor funcțiilor cunoscute ale acesteia din urmă în multe specii bacteriene14,46,48, aceasta potențează recombinarea omoloagă în N. gonorrhoeae și B. subtilis25,26. Pentru a înțelege mai bine rolul recX în răspunsul la stres la micobacterii, s-au construit mutanți knock-out ai recX și recArecX din M. smegmatis. În mod interesant, deleția lui recX în M. smegmatis a dus la un fenotip ușor mai rezistent la toți cei patru agenți de deteriorare a ADN-ului, indicând un posibil câștig de funcție datorat pierderii genei recX. Baza moleculară a acestui efect nu este clară, care pare să merite să fie explorată în studiile viitoare. În timp ce analiza noastră s-a axat în principal pe interacțiunea genetică dintre recA și recX în calea de reparare a ADN-ului prin recombinare, este interesant faptul că recX pare să joace un rol important în creșterea bacteriană. În concluzie, aceste constatări sunt în concordanță cu ideea că recX din M. smegmatis joacă un rol important în procesele de reparare/recombinație a ADN-ului în condiții nefavorabile, poate prin reglarea efectelor dăunătoare ale unui subset de gene încă necunoscute.

Abbreviațiile utilizate sunt

DTT, ditiotreitol; EDTA, acid etilendiamină tetraacetic; kb, kilobază; MMS, metilmetan sulfonat; ODN, oligonucleotid; PAGE, electroforeză în gel de poliacrilamidă; PVDF, membrană de difluorură de poliviniliden; RT-qPCR, reacție în lanț de polimerizare cantitativă cu transcriere inversă; SDS, dodecil sulfat de sodiu; ssDNA, ADN monocatenar; SSC, 0.15 M NaCl-0,015 M citrat de sodiu (pH 7,0).

.