Braz J Med Biol Res, octombrie 2003, Volumul 36(10) 1447-1454
Gena 5-alfa-reductazei de tip 1, dar nu și de tip 2, este exprimată în firele de păr anagen smulse din zona vertexului scalpului femeilor hirsute și a indivizilor normali
I.O. Oliveira1,2, C. Lhullier1, I.S. Brum1 și P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil
Rezumat
Rezumat 
Obiectivul prezentului studiu a fost de a determina expresia genelor pentru tipul 1 (SDR5A1) și tipul 2 (SDR5A2) 5a-izoenzimele reductazei în părul scalpului smuls de la 33 de paciente hirsute (20 cu sindromul ovarelor polichistice și 13 cu hirsutism idiopatic) și să o comparăm cu cea a 10 bărbați și 15 femei normale. Expresia SDR5A1 și SDR5A2 a fost estimată prin RT-PCR folosind gena proteinei ß2-microglobulină, exprimată omniprezent, ca și control intern. Rezultatele sunt exprimate ca unități arbitrare în raport cu absorbția ß2-microglobulinei (medie ± SEM). Expresia SDR5A2 nu a fost detectată în nicio probă de păr analizată în acest studiu. Nu s-au constatat diferențe în ceea ce privește nivelurile ARNm SDR5A1 între bărbați și femeile normale (0,78 ± 0,05 vs. 0,74 ± 0,06, respectiv). Expresia genei SDR5A1 în celulele de păr smuls din scalpul femeilor normale (0,85 ± 0,04) și al femeilor cu sindromul ovarelor polichistice (0,78 ± 0,05) și hirsutism idiopatic (0,80 ± 0,06) a fost, de asemenea, similară. Aceste rezultate indică faptul că expresia genei SDR5A1 în keratinocitele foliculare din zona vertexului scalpului nu pare să fie legată de diferențele de creștere a părului observate între bărbații și femeile normale și pacienții hirsuți. Sunt necesare studii suplimentare pentru a investiga expresia genelor 5a-reductazei în alte compartimente foliculare ale scalpului, cum ar fi papilele dermice, și, de asemenea, în foliculii de păr din alte zone ale corpului, pentru a elucida mecanismul de acțiune a androgenilor asupra procesului de creștere a părului și a bolilor asociate.
Cuvinte cheie: ADN: Foliculul pilos, Hirsutism, 5a-Reductază, Sindromul ovarelor polichistice
Introducere
Androgenii sunt principalii regulatori ai creșterii părului uman și sunt asociați cu una dintre principalele tulburări clinice de creștere a părului, și anume hirsutismul. Această afecțiune corespunde creșterii excesive a părului corporal la femeile cu un model masculin de distribuție a părului corporal. Prezența hirsutismului poate semnala afecțiuni asociate cu secreția crescută de androgeni de către ovare și/sau suprarenale, cum ar fi sindromul ovarelor polichistice (SOPC), tumorile care secretă androgeni și hiperplazia suprarenală neclasică sau poate rezulta din hipersensibilitatea periferică la androgenii circulanți (hirsutism idiopatic, IH) (1-3). Deși, în general, această afecțiune nu pune viața în pericol, este foarte stresantă pentru pacienți și are un impact psihosocial negativ semnificativ. Investigarea efectelor androgenilor asupra creșterii părului în prezența hirsutismului ar trebui să ne îmbunătățească cunoștințele despre biologia foliculului pilos uman.
Efectul tuturor androgenilor activi asupra celulelor țintă este mediat de legarea lor la același receptor nuclear al androgenilor. Studiile anterioare privind sindroamele de rezistență la androgeni au evidențiat importanța receptorului androgenic pentru creșterea părului dependentă de androgeni (4-6). Mai recent, a fost observată o capacitate crescută de legare a androgenilor în celulele capilare ale scalpului bărbaților cu chelie (7). Cu toate acestea, până în prezent, nu s-a constatat nicio diferență consistentă în ceea ce privește numărul sau funcția receptorului de androgeni la pacienții hirsuți în comparație cu subiecții normali (8,9).
Foliculii de păr au un control autonom asupra metabolismului androgenilor, ajustând producția și degradarea hormonilor steroizi în funcție de cerințele locale (10). În condiții normale, 5a-reductaza are un rol-cheie în acțiunea androgenilor asupra foliculilor de păr, transformând testosteronul în dihidrotestosteron, un androgen mai puternic (11,12). Studiile de clonare moleculară au caracterizat două gene care codifică izoenzimele 5a-reductazei de tip 1 și de tip 2 (13,14). Izoenzima 5a-reductazei care predomină în piele este de tip 1 (SDR5A1) (15), care are o omologie de 60 % cu 5a-reductaza de tip 2 (SDR5A2) care este caracteristică prostatei (14). O creștere a activității 5a-reductazei a fost demonstrată în fibroblastele pielii genitale și pubiene de la pacientele hirsute în comparație cu pielea femeilor normale (8,16). Aceste studii au raportat o creștere a activității 5a-reductazei chiar și în cazul IH, care se caracterizează prin absența unor niveluri plasmatice crescute de androgeni (17). Mai mult, pielea pubiană a pacienților hirsuți exprimă aceeași izoformă SDR5A1 ca și pielea pubiană a subiecților normali, în timp ce SDR5A2 este exprimată în principal în pielea genitală atât la subiecții normali, cât și la pacienții hirsuți (18). Cu toate acestea, rolul fiziologic al izoenzimelor 5a-reductazei nu este complet înțeles, iar distribuția acestora în diferite compartimente ale pielii este încă neclară. Unele studii imunohistochimice și de activitate enzimatică au sugerat o expresie predominantă a enzimei SDR5A1 în glandele sebacee, dar și în glandele sudoripare, în celulele epidermice, în teaca radiculară și în celulele papilei dermice din foliculii de păr (19-21), în timp ce SDR5A2 este exprimată în aceste compartimente doar la niveluri foarte scăzute. În schimb, alte studii au demonstrat o distribuție diferită a acestor izoenzime în interiorul unității pilosebacee (22-24). Se pare că există o distribuție mai mare a SDR5A1 în compartimentele foliculului pilos în comparație cu SDR5A2. Mai mult, deoarece keratinocitele din teaca rădăcinii prezintă o expresie ridicată a genei SDR5A1, acestea joacă probabil un rol important în metabolismul androgenilor în foliculii piloși.
Scopul prezentului studiu a fost de a evalua expresia genelor SDR5A1 și SDR5A2 în celulele din teaca rădăcinii firului de păr din zona vertexului scalpului de la pacienții hirsuți și de a o compara cu subiecții normali de ambele sexe.
Pacienți și metode
Subiecți
Populația studiată a inclus femei care au consultat pentru hirsutism, consultate consecutiv pe parcursul unei perioade de 6 luni la Unitatea de Endocrinologie Ginecologică a Spitalului de Clinici din Porto Alegre, Brazilia. Treizeci și trei de paciente cu vârste cuprinse între 12 și 42 de ani au fost selectate pentru studiu. Douăzeci de paciente au fost diagnosticate ca având SOPC și 13 ca având IH. Diagnosticul de SOPC s-a bazat pe trăsăturile fizice de hiperandrogenism, cicluri menstruale perturbate, niveluri serice crescute ale hormonului luteinizant (LH) sau raportul LH/hormonul stimulator al foliculilor, niveluri crescute ale testosteronului total și/sau indicele de androgeni liberi (FAI), dovezi ecografice ale ovarelor polichistice mărite bilateral (25,26) și absența unui neoplasm ovarian sau suprarenal sau a sindromului Cushing. IH a fost diagnosticată așa cum a fost descrisă anterior (27) la pacientele hirsute cu cicluri ovulatorii regulate (niveluri de progesteron în faza luteală mai mari de 3,8 ng/ml), niveluri normale de androgeni și fără nicio boală de bază cunoscută.
Pacientele cu hiperplazie suprarenală congenitală congenitală cu debut tardiv (neclasică) nu au fost luate în considerare pentru studiu pe baza unui nivel plasmatic ridicat al 17-hidroxiprogesteronului (>5 ng/ml) și/sau a creșterii marcante a acestuia după stimularea ACTH (>12 ng/ml) (28,29). Pacienții cu hiperprolactinemie (niveluri serice de prolactină mai mari de 20 µg/l în două ocazii diferite) au fost, de asemenea, excluși.
Cincisprezece femei normale cu cicluri menstruale regulate cu vârste cuprinse între 16 și 37 de ani și zece bărbați cu vârste cuprinse între 16 și 29 de ani au fost, de asemenea, selectați pentru studiu, care a fost aprobat de Comitetul de etică al Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Consimțământul în cunoștință de cauză a fost obținut de la fiecare subiect. Niciunul dintre subiecți nu a primit medicamente cunoscute ca interferând cu nivelurile serice de androgeni, estrogeni sau gonadotropine timp de cel puțin 3 luni înainte de studiu.
Nivelurile ARNm SDR5A1 și SDR5A2 au fost estimate prin reacția de transcriere inversă în lanț a polimerazei (RT-PCR) în celulele capilare smulse din porțiunea de vertex a scalpului bărbaților normali, femeilor normale și pacienților hirsuți.
Protocolul studiului
Măsurătorile antropometrice au inclus greutatea corporală, înălțimea și indicele de masă corporală (IMC = greutatea curentă măsurată în kg împărțită la înălțimea în m2). Scorul de hirsutism a fost clasificat prin metoda Ferriman-Gallwey (30), excluzând zonele de la nivelul gambei și antebrațului.
Evaluarea hormonală a fost efectuată între ziua 2 și 10 a ciclului menstrual sau în orice zi în care pacientele erau amenoreice. După un post de o noapte, au fost prelevate probe de sânge dintr-o venă antecubitală pentru determinarea LH, a globulinei de legare a hormonilor sexuali (SHBG) și a testosteronului total. Toate probele au fost obținute între orele 8 și 10 dimineața. FAI a fost estimată prin împărțirea testosteronului total (nmol/l) la SHBG (nmol/l) x 100.
Teste
Testosteronul total a fost măsurat prin radioimunoanaliză cu dublu anticorp (ICN, Costa Mesa, Costa Mesa, CA, SUA), cu o limită de detecție a testului de 0,5 %.04 ng/ml și un coeficient de variație (CV) intra- și inter-teste de 10 și, respectiv, 15 %; SHBG a fost măsurat printr-un test imunochimiluminometric (ICMA; DPC, Los Angeles, CA, SUA), cu o limită de detecție de 0,2 nmol/l și un CV intra- și inter-teste de 5,0 și, respectiv, 8,0 %. LH a fost măsurată prin ICMA, cu o limită de detecție de 0,7 mIU/ml și un CV intra- și intertest de 5,2 și, respectiv, 8,0 %.
Protocol RT-PCR
Firele de păr anagene smulse au fost recoltate de la vertexul scalpului tuturor subiecților și au fost imediat congelate în azot lichid și transportate la laborator pentru analize. Extracția ARN-ului total și sinteza ADNc au fost efectuate conform descrierii anterioare (31). Rădăcinile de păr smulse au fost omogenizate în izotiocianat de fenol-guanidină (Trizol, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, SUA). ARN-ul total a fost extras cu cloroform și precipitat cu izopropanol prin centrifugare la 12.000 g la 4ºC. Granulețul de ARN a fost spălat de două ori cu etanol 75%, resuspendat în apă tratată cu dietilpirocarbonat și cuantificat prin absorbție la 260 nm.
ADNc de primul șir a fost sintetizat din 5 µg de ARN total pentru toate reacțiile folosind sistemul de preamplificare SuperScript (Gibco-BRL). După denaturarea șablonului de ARN și a amorselor la 70ºC timp de 10 min, s-a adăugat transcriptaza inversă în prezența a 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, plus 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM amestec de dNTP și 10 mM ditiotreitol, și s-a incubat la 42ºC timp de 55 min. Amestecul a fost încălzit la 70ºC pentru a opri reacția și apoi a fost incubat cu E. coli RNase timp de 20 de minute la 37ºC pentru a distruge ARN netranscris. Șablonul (ADNc) utilizat în diferitele teste PCR a fost obținut din aceeași reacție de transcriere inversă. PCR a fost efectuată într-un volum final de 50 µl. Doi microlitri din reacția de sinteză a primului șir (cu un randament estimat de ADNc de 10 ng) au fost denaturați la 94ºC timp de 3 minute (2 minute numai pentru ß2-microglobulină) în prezența a 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, plus 50 mM KCl și 1,5 mM MgCl2. După această pornire la cald, s-a adăugat 1,25 U de ADN polimerază Taq ADN împreună cu același tampon Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM de amorse sens și antisens și 0,2 mM de amestec dNTP.
Un fragment de 368-bp din secvența de ADNc SDR5A1 (24) și un fragment de 566-bp din secvența de ADNc SDR5A2 (14) au fost amplificate cu ajutorul unor primeri concepuți pentru a acoperi granițele intron-exon pentru a preveni amplificarea oricărui ADN genomic contaminant. Un fragment de ADNc de 623-bp corespunzător proteinei ß2-microglobulină (32), exprimată în mod ubicuu, a fost amplificat pentru a normaliza cantitățile de ADNc din fiecare probă. Secvențele ADNc ale primerilor SDR5A1 și SDR5A2 și ale ß2-microglobulinei sunt enumerate în tabelul 1. PCR a fost standardizată prin testarea unui număr de cicluri (20 până la 45), iar amplificarea a fost realizată în intervalul liniar. Condițiile finale ale PCR au fost următoarele: 35 de cicluri (45 s la 94ºC, 45 s la 60ºC, 90 s la 72ºC, 10 min la 72ºC) pentru SDR5A1, 40 de cicluri (1 min la 94ºC, 1 min la 65ºC, 2 min la 72ºC, 5 min la 72ºC) pentru SDR5A2 și 30 de cicluri (1 min la 94ºC, 1 min la 55ºC, 1 min la 72ºC, 5 min la 72ºC) pentru ß2-microglobulină. ADNc din celule disociate din glanda prostatică umană a fost utilizat ca un control pozitiv pentru toate reacțiile PCR. Nu s-a adăugat ADNc la reacțiile negative. Un eșantion din amestecul PCR (15 µl) a fost fracționat pe un gel de agaroză de 1,5-2,0 %, colorat cu bromură de etidiu, analizat la 100 V și vizualizat sub lumină UV. Benzile așteptate au fost cuantificate prin analiză densitometrică cu ajutorul unui sistem de procesare a imaginilor (ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suedia).
Analiza statistică
Datele sunt raportate ca medii ± SEM, cu excepția cazului în care se menționează altfel. Mediile grupurilor au fost comparate prin testul t Student sau prin analiza varianței (ANOVA) cu o singură cale, urmată de testul Duncan, iar valorile mediane au fost comparate prin testul Mann-Whitney. Diferențele au fost considerate ca fiind semnificative din punct de vedere statistic la P < 0,05. Toate analizele au fost efectuate utilizând Statistical Packages for the Social Sciences (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA).
Rezultate
Tabelul 2 rezumă datele antropometrice și hormonale pentru pacienții cu SOPC și IH. Nu s-au observat diferențe semnificative între cele două grupuri de pacienți hirsuți în ceea ce privește vârsta sau scorul clinic pentru hirsutism. Cu toate acestea, pacientele hirsute cu SOPC au prezentat un IMC mai mare și au prezentat niveluri semnificativ mai mari de testosteron, FAI și LH decât grupul IH. Concentrațiile de SHBG au fost mai mici în grupul PCOS decât în grupul IH.
Expresia genei SDR5A2 nu a fost detectată în nicio probă de păr de scalp analizată prin RT-PCR în studiul de față (Figura 1).
Figura 2 prezintă nivelurile de ARNm SDR5A1 în celulele capilare smulse din scalpul subiecților normali. Expresia SDR5A1, prezentată ca unități arbitrare în raport cu absorbția ß2-microglobulinei, a fost similară la bărbați (0,78 ± 0,05) și la femeile normale (0,74 ± 0,06). Mai mult, nu au fost observate diferențe semnificative în ceea ce privește expresia SDR5A1 a keratinocitelor foliculare între femeile normale (0,85 ± 0,04) și grupurile hirsute PCOS (0,78 ± 0,04) sau IH (0,80 ± 0,06) (figura 3).
|
|
Figura 1. Gel de agaroză reprezentativ colorat cu bromură de etidiu care nu arată expresia ARNm SDR5A2 prin RT-PCR în celulele capilare smulse din scalpul bărbaților (de la 1 la 9), al femeilor normale (de la 10 la 17) și al pacienților hirsuți: grupul PCOS (18 până la 31) și grupul IH (32 până la 39). Fragmentul de 566 bp corespunde SDR5A2 (5a-R2), iar fragmentul de 623 bp corespunde ß2-microglobulinei (ß2-m). Amplificarea SDR5A2 a fost vizualizată numai în celulele prostatice disociate utilizate ca și control pozitiv (+). |
|
|
Figura 2. Gel reprezentativ care arată nivelurile de ARNm SDR5A1 determinate prin RT-PCR în celulele capilare smulse din scalpul bărbaților (de la 1 la 7) și al femeilor normale (de la 8 la 14). Fragmentul de 368 bp corespunde SDR5A1 (5a-R1), iar fragmentul de 623 bp corespunde ß2-microglobulinei (ß2-m). Produsele RT-PCR au fost vizualizate pe gel de agaroză colorat cu bromură de etidiu. + = control pozitiv. |
|
|
Figura 3. Gel reprezentativ care arată nivelurile de ARNm SDR5A1 determinate prin RT-PCR în celulele păroase smulse din scalpul femeilor normale (de la 1 la 14) și din ambele grupuri de paciente hirsute (PCOS: de la 15 la 26; IH: de la 27 la 35). Fragmentul de 368 bp corespunde SDR5A1 (5a-R1), iar fragmentul de 623 bp corespunde ß2-microglobulinei (ß2-m). Produsele RT-PCR au fost vizualizate pe gel de agaroză colorat cu bromură de etidiu. |
Discuție
Deși activitatea 5a-reductazei cutanate este asociată cu hirsutismul, rolul specific și identificarea izoenzimei implicate în această afecțiune clinică de creștere a părului trebuie încă să fie mai bine definite. În studiul de față, am investigat expresia ARNm a ambelor tipuri de 5a-reductază în celulele de păr anagene smulse din scalp ale pacienților hirsuți.
Gena SDR5A1 a fost exprimată în celulele de păr smulse obținute din vertexul scalpului la subiecții normali. Alte studii au demonstrat rezultate similare, chiar și atunci când ARNm SDR5A1 a fost investigat în keratinocite foliculare cultivate (24,33). Firele de păr anagene smulse sunt constituite în principal din celule keratinocitare care formează învelișuri radiculare atât externe, cât și interne. Învelișul de țesut conjunctiv, bulbul inferior, celulele papilei dermice și glanda sebacee sunt absente în firele de păr smulse. Prin urmare, datele noastre confirmă expresia genetică a SDR5A1 în keratinocitele foliculare și sunt în concordanță cu altele, care au arătat imunoreactivitatea 5a-reductazei în celulele din teaca rădăcinii foliculilor de păr (20,23).
În studiul de față, nivelurile de ARNm SDR5A1 din firele de păr smulse din scalp nu au fost diferite între bărbații și femeile normale. Studii anterioare au descris, de asemenea, o activitate similară a 5a-reductazei în foliculii de păr de la bărbați și femei (12,34). În schimb, la bărbații normali a fost detectată o activitate 5a-reductază mai mare în probele de piele pubiană decât la femeile normale (1). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că, la indivizii normali, reglarea 5a-reductazei pare să difere între keratinocitele foliculare ale scalpului și fibroblastele pielii pubiene.
Celulele foliculilor de păr din scalp nu par să fie principala țintă a hirsutismului. Cu toate acestea, există unele dificultăți etice în obținerea de eșantioane de pe fața pacienților hirsuți. În plus, există doar câteva rapoarte de literatură despre mecanismele moleculare ale celulelor foliculilor de păr din scalp în prezența hirsutismului (9). Regiunea scalpului este o zonă bine cunoscută ca fiind sensibilă la androgeni la ambele sexe și este relativ ușor de obținut un eșantion de fire de păr din scalp. Prin urmare, este interesant să se investigheze unele aspecte ale metabolismului androgenilor în celulele de păr smulse din scalp, în special atunci când este posibil să se compare subiecții cu o expunere endogenă la niveluri circulante de androgeni mai ridicate (PCOS) sau normale (IH).
Nu am observat diferențe în ceea ce privește nivelurile ARNm SDR5A1 în keratinocitele foliculare nici între pacienții hirsuți și femeile normale, nici între bărbații și femeile normale. Mai mult, pacientele cu niveluri serice ridicate de androgeni (grupul PCOS) au prezentat aceeași expresie a genei SDR5A1 ca și cele cu IH și niveluri normale de androgeni. Deși SDR5A1 este izoenzima care predomină în piele (14), rezultatele prezente indică faptul că androgenii circulanți probabil nu contribuie la expresia genei SDR5A1 în keratinocitele foliculare ale scalpului, sugerând că SDR5A1 nu este izoenzima cheie în metabolismul androgenic local al pielii scalpului. Pe de altă parte, a fost demonstrată eficacitatea finasteridei, inhibitor al 5a-reductazei, în tratamentul căderii părului de tip masculin (35), precum și în IH (36,37). Finasterida este un inhibitor activ pe cale orală care blochează preferențial 5a-reductaza de tip 2, dar poate inhiba și izoenzima de tip 1, determinând o scădere marcantă a nivelurilor de dihidrotestosteron și de glucuronide de 3a-androstenediol. Nu are nici afinitate pentru receptorul androgenic și nici efecte androgenice, estrogenice, progestative sau alte efecte steroidiene (38). În concordanță cu rezultatele noastre, aceste studii au indicat faptul că 5a-reductaza de tip 2 are probabil un rol mai critic în procesul de creștere a părului și în afecțiunile clinice aferente.
Rezultatele prezente arată că gena SDR5A2 nu a fost exprimată în keratinocitele foliculare de la niciun subiect, bărbați sau femei normale sau pacienți hirsuți. Studii anterioare au descris localizarea preferențială a ARNm SDR5A2 și a activității enzimatice (39,40) în celulele papilei dermice, deși imunoreactivitatea SDR5A2 a fost găsită și în keratinocitele din foliculul pilos (20,22). Discrepanțele aparente în ceea ce privește expresia proteică între aceste studii pot fi explicate, cel puțin în parte, prin metodele diferite de analiză imunohistochimică a datelor calitative. În ceea ce privește absența expresiei genei SDR5A2, descrisă în studiul de față, este posibil ca metode mai sensibile de analiză a expresiei genice, de exemplu, PCR în timp real, să clarifice această chestiune în viitor.
Nu am investigat expresia genică a izoenzimelor 5a-reductazei în alte compartimente foliculare, cum ar fi papilele dermice, deoarece aceste celule nu sunt prezente în firele de păr izolate smulse. Celulele papilei dermale sunt obținute doar prin biopsie prin excizie, care este o metodă invazivă și stresantă. Cu toate acestea, va fi foarte interesant să se investigheze izoenzimele 5a-reductazei în celulele papilei dermice de la pacienții hirsuți, deoarece s-a sugerat că aceste celule pot fi ținta directă a androgenilor din foliculii de păr, reglând activitatea matricei părului, a melanocitelor și a keratinocitelor cu semnale paracrine (10).
Expresia genei SDR5A1 în keratinocitele foliculare din zona vertexului scalpului pare să nu fie legată de diferențele în creșterea părului observate între bărbații și femeile normale și pacienții hirsuți. Mai multe investigații cu privire la reglarea expresiei genei 5a-reductazei în celulele foliculului pilos din diferite zone ale corpului pot ajuta la elucidarea mecanismului intrigant al acțiunii androgenilor asupra procesului de creștere a părului și a bolilor asociate.
1. Kuttenn F, Mowszowicz I, Schaison G & Mauvais-Jarvis P (1977). Producția de androgeni și metabolismul cutanat în hirsutism. Journal of Endocrinology, 75: 83-91.
2. New MI, Lorenzen F, Lerner AJ și colab. (1983). Genotiparea deficitului de steroid 21 hidroxilază: date de referință hormonale. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 57: 320-326.
3. Azziz R, Carmina E & Sawaya ME (2000). Hirsutismul idiopatic. Endocrine Reviews, 21: 347-362.
4. Mauvais-Jarvis P, Bercovici JP & Gauthier F (1969). Studii in vivo asupra metabolismului testosteronului de către pielea bărbaților normali și a pacienților cu sindromul de feminizare testiculară. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 29: 417-421.
5. Griffin JE & Wilson JD (1977). Studii privind patogeneza formelor incomplete de rezistență la androgeni la om. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 45: 1137-1143.
6. Kuttenn F, Mowszowicz I, Wright F, Baudot N, Jaffiol C, Robin M & Mauvais-Jarvis P (1979). Pseudohermafroditismul masculin: un studiu comparativ al unui caz de deficiență de 5a-reductază cu trei forme complete de feminizare testiculară. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 49: 861-865.
7. Hibberts NA, Howell AE & Randall VA (1998). Celulele papilei dermice din foliculul de păr chelios conțin niveluri mai ridicate de receptori androgeni decât cele din scalpul care nu este chel. Journal of Endocrinology, 156: 59-65.
8. Mowszowicz I, Melanitou E, Doukani A, Wright F, Kuttenn F & Mauvais-Jarvis P (1983). Capacitatea de legare a androgenilor și activitatea 5-reductazei în fibroblastele de piele pubiană de la pacienți hirsuți. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 56: 1209-1213.
9. Oliveira IO, Lhullier C, Brum IS & Spritzer PM (2003). Expresia genetică a 17ß-hidroxisteroid dehidrogenazei de tip 2 în părul scalpului femeilor hirsute. Steroizi (în curs de publicare).
10. Randall VA (1994). Androgeni și creșterea părului uman. Clinical Endocrinology, 40: 439-457.
11. Hay JB & Hodgins MB (1973). Metabolismul androgenilor in vitro de către pielea umană facială și axilară. Journal of Endocrinology, 59: 475-486.
12. Takayasu S, Wakimoto H, Itami S & Sano S (1980). Activitatea testosteronului 5a-reductazei în diferite țesuturi ale pielii umane. Journal of Investigative Dermatology, 74: 187-191.
13. Andersson S, Bischop RW & Russell DW (1989). Expresia, clonarea și reglementarea steroidului 5a-reductazei, o enzimă esențială pentru diferențierea sexuală masculină. Journal of Biological Chemistry, 264: 16249-16255.
14. Andersson S, Berman DM, Jenkins EP & Russell DW (1991). Deleția genei steroid 5a-reductazei 2 în pseudohermafroditismul masculin. Nature, 354: 159-161.
15. Harris G, Azzolina B, Baginsky W, Cimis G, Rasmusson G, Tolman R, Raetz C & Ellsworth K (1992). Identificarea și inhibarea selectivă a unei izoenzime a steroidului 5a-reductazei în scalpul uman. Proceedings of the National Academy of Sciences, SUA, 89: 10787-10791.
16. Lobo RA, Goebelsmann U & Horton R (1983). Dovezi pentru importanța evenimentelor tisulare periferice în dezvoltarea hirsutismului în sindromul ovarelor polichistice. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 57: 393-397.
17. Serafini P & Lobo RA (1985). Activitatea crescută a 5-reductazei în hirsutismul idiopatic. Fertilitatea și sterilitatea, 43: 74-78.
18. Mestayer CH, Berthaut I, Portois M-C, Wright F, Kuttenn F, Mowszowicz I & Mauvais-Jarvis P (1996). Expresia predominantă a 5a-reductazei de tip 1 în pielea pubiană de la subiecți normali și pacienți hirsuți. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 81: 1989-1993.
19. Luu-The V, Sugimoto Y, Puy L, Labrie Y, Solache IL, Singh M & Labrie F (1994). Caracterizarea, expresia și localizarea imunohistochimică a 5a-reductazei în pielea umană. Journal of Investigative Dermatology, 102: 221-226.
20. Eicheler W, Dreher M, Hoffmann R, Happle R & Aumüller G (1995). Dovezi imunohistochimice pentru distribuția diferențială a izoenzimelor 5a-reductazei în pielea umană. British Journal of Dermatology, 133: 371-376.
21. Chen W, Zouboulis CC, Fritsch M, Blume-Peytavi U, Kodelja V, Goerdt S, Luu-The V & Orfanos CE (1998). Dovezi ale eterogenității și diferențelor cantitative ale expresiei 5a-reductazei de tip 1 în celulele cultivate ale pielii umane: dovezi ale prezenței sale în melanocite. Journal of Investigative Dermatology, 110: 84-89.
22. Bayne EK, Flanagan J, Einstein M et al. (1999). Localizarea imunohistochimică a tipurilor 1 și 2 de 5a-reductază în scalpul uman. British Journal of Dermatology, 141: 481-491.
23. Sawaya ME & Price VH (1997). Niveluri diferite de 5a-reductază de tip I și II, aromatază și receptor de androgeni în foliculii de păr ai femeilor și bărbaților cu alopecie androgenetică. Journal of Investigative Dermatology, 109: 296-300.
24. Courchay G, Boyera N, Bernard BA & Mahe Y (1996). Expresia ARN-ului mesager al subtipurilor de enzime de steroidogeneză în unitatea pilosebacee umană. Skin Pharmacology, 9: 169-176.
25. Adams J, Franks S, Polson DW, Mason HD, Abdulwahid N, Tucker M, Morris DV, Price J & Jacobs HC (1985). Ovarele multifolliculare: caracteristici clinice și endocrine și răspunsul la hormonul eliberator de gonadotropină pulsatil. Lancet, 2: 1375-1379.
26. Herter LD, Magalhães JA & Spritzer PM (1996). Relevanța determinării volumului ovarian la fetele adolescente cu tulburări menstruale. Journal of Clinical Ultrasound, 24: 243-248.
27. Spritzer PM, Oppermann-Lisboa K, Mattiello S & Lhullier F (2000). Utilizarea spironolactonei ca agent unic pentru tratamentul pe termen lung al pacienților hirsuți. Endocrinologie clinică, 52: 587-594.
28. Spritzer PM, Billaud L, Thalabard J, Kuttenn F & Mauvais-Jarvis P (1990). Tratamentul cu acetat de ciproteron versus tratamentul cu hidrocortizon în hiperplazia suprarenală cu debut tardiv. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 70: 642-645.
29. Azziz R, Dewailly D & Owerbach D (1994). Hiperplazia suprarenală neclasică: concepte actuale. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 78: 810-815.
30. Ferriman D & Gallwey JD (1961). Evaluarea clinică a creșterii părului corporal la femei. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 21: 1140-1148.
31. Reis FM, Maia AL, Ribeiro MFM & Spritzer PM (1999). Modularea cu progestativ a expresiei genelor c-fos și prolactină în endometrul uman. Fertility and Sterility, 71: 1125-1132.
32. Taplin ME, Bubley GJ, Shuster TD, Frantz ME, Spooner AE, Ogata GK, Keer HN & Balk SP (1995). Mutația genei receptorului de androgeni în cancerul de prostată metastatic androgen-independent. New England Journal of Medicine, 332: 1393-1398.
33. Eicheler W, Huth A, Happle R & Hoffmann R (1996). Nivelurile de ARN ale 5a-reductazei și ale receptorului de androgeni în pielea umană, foliculii de păr și celulele derivate din folicul. În: In: Van Neste DJJ & Randall VA (Editori), Hair Research for the Next Millenium. Elsevier Science, Amsterdam, 327-331.
34. Schweikert HU & Wilson JD (1974). Reglarea creșterii părului uman de către hormonii steroizi. I. Metabolismul testosteronului în firele de păr izolate. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 38: 811-819.
35. Kaufman KD, Olsen EA, Whiting D și colab. (1998). Finasterida în tratamentul bărbaților cu alopecie androgenetică. Grupul de studiu Finasteride Male Pattern Hair Loss Study Group. Journal of the American Academy of Dermatology, 39: 578-589.
36. Tartagni M, Schonauer LM, De Salvia MA, Cicinelli E, De Pergola G & D’Addario V (2000). Comparația dintre Diane 35 și Diane 35 plus finasteridă în tratamentul hirsutismului. Fertility and Sterility, 73: 718-723.
37. Sahin Y, Diller S & Kelestimur F (2001). Comparația dintre Diane 35 și Diane 35 plus finasteridă în tratamentul hirsutismului. Fertilitatea și sterilitatea, 75: 496-500.
38. Rittmaster RS (1994). Finasterida. New England Journal of Medicine, 330: 120-125.
39. Asada Y, Sonoda T, Ojiro M, Kurata S, Sato T, Ezaki T & Takayasu S (2001). 5a-Reductaza de tip 2 este exprimată constitutiv în papila dermică și învelișul de țesut conjunctiv al foliculului pilos in vivo, dar nu și în timpul culturii in vitro. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 86: 2875-2880.
40. Eicheler W, Happle R & Hoffmann R (1998). Activitatea 5a-Reductazei în foliculul de păr uman se concentrează în papila dermică. Archives of Dermatological Research, 290: 126-132.