Rezultate și discuții
Sesizarea „fluxului autofagic” descrisă în Jiang et al. este o testare cantitativă a proteinei verzi fluorescente (GFP) care măsoară modificările ratiometrice ale polyQ-GFP în GFP liberă prin analiza Western blot. A fost concepută o construcție reporter multicistronică pentru a codifica două proteine; polyQ legată de GFP N-terminală și GFP liberă. Secvența virală 2A (v2A) a fost plasată ca o regiune de legătură între secvențele care codifică cele două proteine pentru a permite traducerea stoichiometrică a două proteine separate dintr-un singur cadru de citire deschis (Fig. 1a) .
Generarea construcțiilor putative Q52, Q31 și Q10-GFP folosind construcția reporter multicistronică Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. a Harta vectorială a construcției Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. b Rezumat al utilizării codonilor degenerate CAA și CAG în această construcție. c Cromatografie a construcției care descrie tripletele CAG și CAA de codificare a glutaminei intercalate aleatoriu. d Ilustrație schematică a amplificării de excludere pe bază de PCR a construcției care conține Q80-GFP pentru a genera construcții poliQ cu un număr mai mic de repetări de glutamină. e Secvența Q80 care arată situsurile de legare a amorselor Q52, Q31 și Q10. f Secvențele amorselor destinate generării construcțiilor Q52, Q31 și Q10. g Electroforeza analitică pe gel de agaroză pentru fiecare dintre vectorii putativi Q80, Q52, Q31 și Q10 utilizând amorsă care flanchează regiunea poliQ. Au fost observate dimensiuni ale produsului PCR de ~ 270, ~ 180, ~ 120 și ~ 60 bp pentru construcțiile presupuse Q80, Q52, Q31 și, respectiv, Q10-GFP
Am proiectat o secvență polyQ care conține 80 de repetări de glutamină (Q80). Secvența a fost proiectată pentru a avea o similitudine scăzută a repetițiilor prin intercalarea aleatorie a tripletelor CAG care codifică glutamina cu tripletele CAA care codifică glutamina (Fig. 1b, c). Substituțiile de nucleotide au fost făcute cu ochiul liber pentru a genera un model semialeator. Acest design nerepetitiv al secvenței nu numai că ar trebui să sporească stabilitatea secvenței în timpul propagării în bacterii, dar a permis, de asemenea, proiectarea de primeri PCR care să se aneantizeze la regiuni specifice ale secvenței.
Construcția Q80-GFP-v2A-GFP descrisă mai sus a fost sintetizată în comerț (Biomatik Corporation) (a se vedea fișierul suplimentar 1) și subclonată prin intermediul situsurilor de restricție BamHI și ClaI în vectorul de transfer de gene pT2AL200R150G, bazat pe transpozonul Tol2 (denumit în continuare Tol2), disponibil la laboratorul Kawakami (Fig. 1a și a se vedea fișierul suplimentar 2).
Construcțiile PolyQ cu un număr mai mic de repetări de glutamină au fost generate prin amplificarea de excludere bazată pe PCR a construcției Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP. Amorsele au fost concepute pentru a amplifica în jurul vectorului excluzând un număr definit de repetări de glutamină pentru a genera construcțiile de interes (Fig. 1d-f). Am urmărit să generăm vectori cu aproximativ 52 (Q52), 31 (Q31) și 10 (Q10) repetări de glutamină. Vectorii putativi Q52 și Q31 au fost generați folosind același amorsă inversă cuplată cu amorsă directă diferită. Acest amorsă inversă comună a amplificat 2 repetări de glutamină, în timp ce amorsă directă a amplificat cele 50 și 29 de repetări de glutamină suplimentare necesare pentru a genera vectorii Q52 și, respectiv, Q31. Poziția amorsă inversă a fost ușor schimbată pentru a optimiza amplificarea vectorului putativ Q10, astfel încât amorsă inversă a amplificat acum 5 repetări de glutamină, în timp ce amorsă directă a amplificat celelalte 5 repetări de glutamină (Fig. 1d-f). Prin utilizarea unor temperaturi de recoacere riguroase în reacția PCR am obținut o legare specifică a amorselor. Produsele PCR extrase pe gel și purificate au fost fosforilate, circularizate prin autolegare și ulterior transformate în celule competente (a se vedea fișierul suplimentar 3). PCR folosind primeri care au flancat regiunea polyQ a arătat aproximativ dimensiunile așteptate ale produsului pentru vectorii putativi presupuși Q52, Q31 și Q10 (figura 1g). Construcțiile generate au fost secvențiate pentru a determina dacă numerele de repetări poliQ așteptate erau prezente. În timp ce construcția Q52 avea numărul așteptat de repetări de glutamină (Fig. 2a, b), secvențierea a evidențiat discrepanțe minore cu numerele de poliQ așteptate pentru celelalte două construcții, în care vectorul Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP avea 21 de repetări de glutamină (denumit în continuare Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2c, d), iar vectorul Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP avea 11 repetări de glutamină (denumit în continuare Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (Fig. 2e, f). O analiză suplimentară a arătat că secvența Q21 generată a fost derivată direct din secvența originală, iar pierderea repetărilor de glutamină s-a datorat faptului că primerul Q31 forward s-a legat la 30 bp în aval de situsul de legare prezis. În schimb, repetiția suplimentară de glutamină din secvența Q11 a fost generată de novo, o adăugare a unui codon CAA.
Harta vectorială și analiza secvenței construcțiilor care codifică pentru Q52, Q21 și Q11-GFP generate prin amplificare prin excizie bazată pe PCR. a Harta vectorială a construcției Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP. b Cromatografia construcției Q52. c Harta vectorială a construcției Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP. d Cromatografie a construcției Q21. e Harta vectorială a construcției Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP. f Cromatografia construcției Q11
Pentru a studia cinetica de agregare și „fluxul autofagic” al proteinei polyQ in vivo, am injectat vectorii polyQ generați (25 ng/μL) și ARNm de transpozază (25 ng/μL) în grupuri de embrioni de pește zebră în stadiu de o celulă (Fig. 3a, b). Pentru fiecare grup s-a efectuat analiza Western blot cu anticorp anti-GFP a lizatului embrionar de 24 de ore după fertilizare (hpf) (10 embrioni per eșantion). Embrionii injectați și neinjectați cu vectorul Tol2 gol (25 ng/μL) și ARNm al transpozazei (25 ng/μL) au fost incluși ca martori. Embrionii injectați cu construcțiile polyQ au produs două benzi detectate de anticorpul anti-GFP, așa cum era de așteptat; GFP atașată la polyQ (polyQ80-GFP la ~ 48 kDa, polyQ52-GFP la ~ 38 kDa, polyQ21-GFP la ~ 33 kDa și polyQ11-GFP la ~ 31 kDa) și GFP liberă (~ 27 kDa) (Fig. 3c). Fiecare dintre lizații de embrioni care exprimă construcția polyQ-GFP a prezentat, de asemenea, o bandă mai slabă de dimensiuni proteice mai mari, care corespunde construcției polyQX-GFP-v2A-GFP de lungime completă (polyQ80-GFP-v2A-GFP la ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP la ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP la ~ 60 kDa și polyQ11-GFP-v2A-GFP la ~ 58 kDa). Această bandă reprezintă ~ 10% din proteina totală care este tradusă ca o singură proteină de lungime completă atunci când se utilizează sistemul de secvențe v2A . Rapoartele Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP și Q11-GFP:GFP sunt ~ 5, ~ 4, ~ 2 și, respectiv, ~ 1 (Fig. 3d). Deoarece secvența v2A permite traducerea stoichiometrică a proteinelor polyQ-GFP și GFP, în teorie, raportul polyQ-GFP:GFP ar trebui să fie de 1. Rapoartele mai mari observate pot indica o acumulare a acestor proteine. Aceste observații sunt în concordanță cu literatura de specialitate, unde s-a demonstrat că construcțiile de fuziune polyQ-GFP care conțin mai mult de 19 reziduuri de glutamină se agregă în celulele transfectate într-o manieră dependentă de lungime. Aceste observații ne conduc la concluzia că construcțiile noastre Tol2-QX-GFP-v2A-GFP oferă un instrument util pentru a studia „fluxul autofagic” in vivo într-un model larvar de pește zebră.
Analiză a expresiei construcției Tol2-QX-GFP-v2A-GFP în D. rerio. Embrionii de pește zebră au fost injectați cu 25 ng/µL din construcția Tol2-QX-GFP-v2A-GFP și 25 ng/µL de ARNm care codifică transpoza Tol2. a Imagini în câmp luminos (panouri superioare) și fluorescente (panouri inferioare) ale imaginii din partea stângă a regiunilor capului și trunchiului embrionului de pește zebră care exprimă Q80, Q52, Q21 și Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Imagini în câmp luminos (panouri de sus) și imagini fluorescente (panouri de jos) ale regiunilor trunchiului și cozii embrionului de pește zebră care exprimă Q80, Q52, Q21 și Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Analiza Western blot a expresiei construcțiilor Qx-GFP în D. rerio. Proteinele au fost izolate din embrioni de ~ 24 hpf care exprimă construcțiile Q80, Q52, Q21 și Q11-GFP. Proteinele au fost rezolvate pe un gel SDS-PAGE 10% și transferate pe o membrană de nitroceluloză. Membrana a fost probată cu un anticorp anti-GFP. Vectorul Tol2 „gol” posedă o genă GFP exprimată care este înlocuită în timpul inserției construcției. d Cuantificarea prin Western blot. Sunt prezentate intensitatea GFP pentru fiecare bandă numerotată din Western blot și raportul Qx-GFP la GFP liberă
Concluzie
În concluzie, acest studiu oferă o soluție robustă și ușor de adoptat pentru a genera lungimi apropiate de cele dorite de repetări polyQ. Pentru a genera un număr exact de repetări de glutamină, se pot efectua runde ulterioare de amplificări cu secvențe de amorsă modificate. În plus, lungimea amorselor poate fi mărită pentru a spori specificitatea aneantizării amorselor la șablon. Tehnica noastră prezintă mai multe avantaje față de metodele existente de amplificare pe bază de PCR a regiunilor repetitive și urmărește să reducă la minimum generarea de produse PCR nespecifice și de repetări defectuoase prin exploatarea redundanței codonice a codului genetic pentru a genera o secvență sinonimă de codificare a ADN-ului cu o repetiție redusă. În plus, abordarea noastră nu se limitează la generarea de secvențe repetate polyQ, ci poate fi generalizată pentru a genera și alte secvențe repetate de nucleotide. În plus, metoda noastră este relativ ieftină, deoarece doar construcția inițială polyQ80-GFP-v2A-GFP necesită o sinteză comercială, al cărei cost depinde de prețul per bază nucleotidă, lungime, puritate și masă. Toate celelalte materiale necesare sunt reactivi standard utilizați pentru clonarea moleculară. În concluzie, tehnica descrisă oferă o soluție ușor de adoptat, la un preț accesibil, pentru a genera secvențe de ADN cu codificare repetată care pot fi manipulate în funcție de necesități.
.