Oligonucleotide antisens direcționate către SMN2
ASO-urile sunt acizi nucleici monocatenari sintetizați pentru a fi complementari unei secvențe de ARN țintă. Odată administrat, ASO este preluat în celulă printr-un mecanism endocitar încă slab definit și apoi intră în nucleu, unde se leagă de preARNm-ul său țintă.62 Inițial, ASO au fost utilizați pentru a suprima expresia genelor fie prin blocarea traducerii unui ARN țintă, fie prin promovarea degradării acestuia. În prezent, ASO-urile pot fi, de asemenea, concepute pentru a modifica procesarea sau splicarea unei ținte. ASO terapeutice pentru SMA sunt concepute pentru a modifica splicingul alterat al SMN2 pre-ARNm astfel încât exonul 7 să fie inclus în transcriptul final procesat. După cum s-a discutat în capitolele anterioare, SMN2 diferă de SMN1 printr-o tranziție de la C la T care are loc la șase nucleotide în exonul 7 (există și alte diferențe între cele două secvențe, dar aceasta este cea mai importantă din punct de vedere funcțional). Tranziția de la C la T creează un context inhibitor extins în exonul 7 (cunoscut și sub numele de „Exinct”).63 Deoarece exonul 7 este altfel slab definit datorită unui situs de joncțiune 5′ slab, mutația de la C la T în SMN2 este suficientă pentru a înclina balanța de la includerea sa la excludere.
Elementele de reglare a joncțiunii joacă un rol important în determinarea situsurilor care sunt recunoscute de mașinăria de joncțiune celulară. Locația și funcția elementelor relevante ale SMN2 au fost identificate prin analiza efectului de splicing al unei serii extinse de ASO concepute pentru a completa secvența SMN2 într-un mod iterativ progresiv.63-66 Silențatorul intronic de splicing ISS-N1 a fost identificat ca fiind un element de silențiere foarte puternic prin această metodă; motivul este localizat în aval de situsul de 5′-splicing al exonului 7 și se leagă de reprimatorul de splicing hnRNP A1.66-68 ASO au fost concepute pentru a induce în mod fiabil includerea exonului 7 prin direcționarea ISS-N1 sau a altor elemente de reglementare.
ASO-urile pot fi concepute pentru a fi bifuncționale. De exemplu, s-a demonstrat că ASO-urile chimerice care fuzionează domeniile de recrutare SR (peptida RS) cu o secvență antisens care suprimă motivele silențioase cresc incluziunea exonului 7 și nivelurile proteinei SMN în fibroblastele pacienților; o singură injecție a ASO-ului bifuncțional a fost capabilă să inducă proteina SMN în creierul șoarecilor nou-născuți și a dus la prelungirea duratei de viață.65,69 Această strategie de proiectare ASO, cunoscută sub numele de ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), a fost inițial urmărită în terapeutica SMA, dar studiile ulterioare au arătat că peptida RS nu era necesară pentru a obține un efect robust asupra incluziunii exonului 7 al SMN2. Deoarece o abordare chimerică introduce dificultăți în fabricarea ASO și limitează permeabilitatea celulară a ASO, ASO-urile bifuncționale nu au fost testate pe scară largă la șoareci și nu sunt în prezent dezvoltate clinic.62
După ce s-a demonstrat că ASO-urile care vizează ISS-N1 sunt remarcabil de eficiente în promovarea incluziunii exonului 7, următoarea întrebare strategică a fost identificarea coloanei vertebrale ASO care ar fi cel mai bine utilizată într-o potențială terapie SMA. Oligonucleotidele care compun un ASO sunt de obicei modificate pentru a optimiza proprietățile farmaceutice, cum ar fi absorbția celulară, toxicologia, farmacocinetica și legarea la țintă. O adaptare comună, rezultată în urma unei colaborări între Ciba-Geigy Ltd. (cunoscută în prezent sub numele de Novartis) și Isis Pharmaceuticals (cunoscută în prezent sub numele de Ionis Pharmaceuticals), este 2′-O-metoxietil (2′-MOE), care crește atât rezistența ASO la degradarea nucleazei, cât și afinitatea de hibridizare.70 Oligonucleotidele 2′-MOE s-au dovedit a fi foarte sigure la rozătoare și primate, inclusiv la om.62 Administrarea unui ASO 2′-MOE care blochează ISS-N1 a crescut cu succes exonul 7 al SMN2 într-o manieră dependentă de doză și de timp la șoarecii SMA, ameliorând patologia neuromusculară și crescând dramatic supraviețuirea.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals, în colaborare cu Biogen, dezvoltă un tratament cu ASO 2′-MOE numit nusinersen (cunoscut și sub numele de IONIS-SMNRx și denumit anterior ISIS-SMNRx). Studiile preclinice ale nusinersenului la primate neumane au demonstrat că o singură injecție intratecală ar putea duce la concentrațiile tisulare necesare pentru îmbunătățiri semnificative ale incluziunii exonului 7, iar aceste concentrații au fost menținute timp de mai multe luni.62 Timpul de înjumătățire îndelungat al medicamentului înseamnă că pacienții ar putea avea nevoie de o injecție intratecală doar la câteva luni.73 Într-un studiu deschis de fază 1 la pacienții cu SMA de tip II/III cu vârste cuprinse între 2 și 14 ani, o singură injecție de nusinersen a fost bine tolerată și se pare că a fost corelată cu creșterea scorurilor HFMSE la cea mai mare doză.74 În iunie 2015, Ionis a publicat noi date dintr-un studiu deschis în curs de desfășurare de fază 2 cu nusinersen la copiii de tip I, care au arătat că aceștia au trăit mai mult și au atins mai multe repere motorii decât ceea ce ar fi fost de așteptat în mod normal din istoricul natural al bolii.75 În plus, mecanismul de acțiune al medicamentului a fost susținut de date care arată o creștere a cantității de ARNm SMN2 de lungime completă și a proteinei SMN în țesuturile creierului și ale măduvei spinării din autopsiile pacienților care au primit tratament. Ionis a publicat, de asemenea, date din studiul de prelungire deschis de fază 2 la copiii cu SMA de tip II/III, care arată că 57% dintre subiecți au obținut o îmbunătățire de cel puțin trei puncte la testul HFMSE și o îmbunătățire medie de 55 m la testul de mers pe jos de 6 minute (6MWT).76 În prezent, se desfășoară studii de fază 3 cu nusinersen atât la sugari, cât și la adulți cu AMS (NCT02193074; NCT02292537); rezultatele ar trebui să fie disponibile în 2017.
Deși nu au fost observate încă probleme de siguranță legate de utilizarea 2′-MOE în tratamentul AMS, unele toxicități au fost asociate cu ASO 2′-MOE la alte populații de pacienți.77,78 O altă modificare a coloanei vertebrale care este în curs de explorare pentru utilizarea în SMA și care ar putea eluda aceste probleme este oligomerii morfolino fosfoamidați (PMOs). PMOs s-au dovedit a fi mai eficienți decât 2′-MOE în modelele de șoareci de distrofie musculară Duchenne (DMD), o altă boală neuromusculară pediatrică, și au fost, de asemenea, bine tolerați la pacienții cu DMD.79 O injecție ICV de ASO morfolino complementare la ISS-N1 a îmbunătățit semnificativ supraviețuirea șoarecilor SMA fără semne de toxicitate la nivelul sistemului nervos central (SNC).80,81 Un morfolino orientat spre ISS-E1, un amortizor de splicing intronic care se găsește în amonte de exonul 7, îmbunătățește, de asemenea, fenotipul șoarecilor SMA.82 Această abordare nu a fost încă transpusă în clinică.
Chimia de bază a unui ASO poate avea un impact asupra adecvării la diferite metode de administrare, asupra necesității de a repeta dozarea și poate conferi toxicități asociate – toate acestea având implicații importante pentru utilizarea sa terapeutică. Mai mult, un ASO utilizat pentru tratarea SMA trebuie să rămână activ din punct de vedere farmacologic în țesuturile din SNC, în special în neuronii motori. Indiferent de coloana vertebrală, orice ASO conceput pentru tratamentul SMA va trebui probabil să fie administrat direct în lichidul cefalorahidian prin injecție intratecală. Deși unele studii care au utilizat administrarea periferică de ASO la șoareci nou-născuți au arătat eficacitate, bariera hemato-encefalică nu este complet formată la șoarecii tineri și un ASO administrat periferic este capabil să pătrundă în SNC într-un grad care nu este posibil la om.71 În mod încurajator, s-a demonstrat că ASO-urile injectate intratecal se distribuie pe scară largă printre țesuturile importante ale SNC, cum ar fi neuronii motori, astrocitele și microglia.72,83-85
Deși injectarea intratecală este oarecum invazivă și necesită sedare sau anestezie, ASO-urile au mai multe avantaje semnificative față de alte modalități experimentale, inclusiv o specificitate ridicată a țintei, o eficacitate remarcabilă, o toxicitate redusă în comparație cu administrarea sistemică a ASO-urilor și procese de fabricație relativ simple în comparație cu produsele biologice (dar nu și cu moleculele mici). Mai multe informații se găsesc în capitolul 18.
.