Practică pentru Genetica Umană Viena

Cercetare de microaberații la nivelul întregului genom: Array-CGH

Sindroamele complexe bazate pe multiplicarea sau reducerea materialului cromozomial sunt cunoscute de mult timp. În cazul trisomiei 21, de exemplu, un cromozom complet este prezent de trei ori în loc de două. În sindroamele de microdeleție, cum ar fi sindromul Williams-Beuren, Prader-Willi sau Smith-Magenis, lipsesc secțiuni mai mult sau mai puțin definite ale unui cromozom, de obicei la o scară submicroscopică de câteva megabaze. În cazul bolilor monogenetice, au fost descoperite recent, cu o frecvență din ce în ce mai mare, deleții sau duplicații ale unor gene individuale sau segmente de gene ca fiind cauza bolii.

Tehnicile utilizate până în prezent în diagnosticarea unor astfel de modificări ale dozării genelor au limitele lor: De exemplu, deși metodele de citogenetică moleculară, cum ar fi FISH, sau metodele de genetică moleculară, cum ar fi MLPA, pot fi utilizate cu rezoluție înaltă sau maximă, acestea trebuie să știe sau să presupună a priori ce zonă a genomului este afectată. Pe de altă parte, citogenetica clasică sau tehnica CGH („hibridizare genomică comparativă”: hibridizarea comparativă a ADN-ului pacientului și a ADN-ului de referință pe cromozomi în metafază) poate acoperi întregul genom, dar rezoluția este limitată la aproximativ 5 Mb, în cel mai bun caz, din cauza utilizării microscopului optic.

Pentru a depăși aceste limitări ale tehnicilor existente, array CGH este o alternativă adecvată.

În acest caz, tehnica CGH convențională este combinată cu experiența dobândită din analiza expresiei cu ajutorul microarrays: Fragmente definite de ADN imobilizate pe suprafața unei lamele de sticlă servesc drept ținte de hibridizare, iar termenul „matrice” se referă la dispunerea regulată, în formă de grilă, a acestor fragmente. Fragmentele sunt selectate pentru a acoperi genomul uman cât mai uniform posibil.

Pentru analiză, cantități aproximativ egale de ADN al pacientului și de ADN genomic de referință sunt cohibridate pe matrice. Deoarece probele de ADN ale pacientului și cele de referință sunt marcate cu coloranți fluorescenți diferiți, o modificare numerică în genomul pacientului duce la o schimbare de culoare a semnalului fluorescent al fragmentelor individuale prin schimbarea raportului de hibridizare.

Reprezentare schematică a tehnicii array CGH:

în scaner detectează semnalele fluorescente și înregistrează schimbările de culoare. Cu ajutorul unui software adecvat, semnalele sunt atribuite regiunii genetice și, în cele din urmă, rezultatul poate fi afișat, de exemplu, sub forma unei „cariograme”, care arată în ce punct al unui cromozom sunt prezente modificări.

Afișarea unui rezultat al matricei CGH: duplicarea regiunii Xp11-p21.1 (creată la ZMG cu CGHAnalytics, Agilent)

Numărul și densitatea fragmentelor de pe matrice determină rezoluția matricei CGH. În prezent, sunt disponibile matrici cu acoperire a întregului genom uman la rezoluții cuprinse între 1 Mb și aproximativ 35 kb. Datorită creșterii constante a numărului de fragmente pe matrice, rezoluția va continua să crească. Astfel, dezechilibrele genelor individuale pot fi detectate în mod fiabil.

Aplicații ale array CGH

Array CGH este, prin urmare, o tehnică prin care genomul complet al unui pacient poate fi analizat la rezoluție înaltă pentru depistarea abaterilor de la dozarea normală a genelor. Devine din ce în ce mai important ca metodă inovatoare de screening, deși a fost utilizat pentru prima dată în primul rând în diagnosticarea tumorilor. Acest lucru se datorează faptului că progresia tumorală este caracterizată de o acumulare de aberații care pot fi însoțite de amplificarea oncogenelor și deleția genelor supresoare de tumori.

ArrayCGH prezintă un interes deosebit pentru diagnosticarea cazurilor de retard mental inexplicabil. În citogenetica standard, aberațiile sunt vizibile în aproximativ 5% din cazuri la pacienții cu retard mintal și semne suplimentare de dismorfie sau grupări familiale. Screeningul subtelomerilor cu FISH sau MLPA poate găsi o cauză în încă 5% din cazuri. Studii recente arată că matricea CGH cu o rezoluție de aproximativ 1 Mb dezvăluie dezechilibre genomice la 10-15 % dintre pacienții cu un cariotip discret și rezultate negative la subtelomeri. (a se vedea literatura de specialitate). Se presupune că această rată de detecție va crește odată cu creșterea rezoluției rețelelor. Unele grupuri de cercetare recomandă deja array CH ca prim pas de diagnosticare în cazurile de retard mintal inexplicabil.

Cu toate acestea, array CH nu numai că detectează noi dezechilibre, dar poate fi folosită și pentru a determina cu precizie dimensiunea deleției, localizarea punctelor de ruptură sau originea materialului suplimentar în cazurile de pierdere sau câștig de regiuni cromozomiale vizibile din punct de vedere citogenetic. Acest lucru este important pentru o corelație exactă între genotip și fenotip și pentru identificarea genelor candidate implicate în dezvoltarea RM și a dismorfiei. În cazul unor anomalii cromozomiale considerate anterior ca fiind translocații „echilibrate”, array CGH a reușit să demonstreze că materialul genetic este șters sau duplicat în regiunea punctelor de ruptură și că, prin urmare, este prezentă o translocație dezechilibrată. Astfel, cu ajutorul array CGH, constatările citogenetice devin mai precise și sunt corectate.

Așadar, în timp ce granițele dintre citogenetică și genetica moleculară devin din ce în ce mai neclare, cariotiparea rămâne importantă deoarece anumite modificări cromozomiale nu sunt detectabile cu array CGH: Poliploidii, adevărate translocații echilibrate și stări mozaice cu o proporție mică de celule aberante.

Datorită ratei ridicate de detecție pe întreg genomul și faptului că nu este necesară o cultură celulară care necesită timp și muncă intensivă, array CGH deschide noi posibilități pentru diagnosticul prenatal.

Dar, cu toate avantajele și posibilitățile acestei tehnici de pionierat, nu trebuie să uităm că saltul de la cercetare la diagnosticare este abia acum în curs de realizare. Astfel, array CGH nu numai că clarifică întrebările deschise, dar interpretarea rezultatelor poate, de asemenea, să ridice noi întrebări:

Cu ajutorul studiilor array CGH, s-a descoperit că genomul uman conține o proporție neașteptat de mare de regiuni al căror număr de copii variază la oamenii normali din punct de vedere fenotipic (vezi literatura de specialitate). Dimensiunea acestor CNV-uri („variații ale numărului de copii”) variază de la câteva kilobaze la câteva megabaze. Se estimează că fiecare individ este purtător a cel puțin 3-11 astfel de variații. Bazele de date care enumeră astfel de polimorfisme (adică mutațiile care nu afectează în mod evident fenotipul) sunt abia în curs de creare și, prin urmare, sunt încă incomplete. Dacă în prezent se găsesc aberații în ADN-ul unui pacient prin matrice CGH, este adesea speculativ dacă acestea sunt responsabile pentru fenotip. În cele mai multe cazuri, este necesar să se examineze și ADN-ul părinților.

Probabilitatea ca o aberație cromozomială să fie cauzatoare de boală crește

• cu mărimea aberației
• dacă aceasta este prezentă „de novo”, părinții nu sunt purtători ai acestei aberații
• dacă nu este listată în nicio bază de date de polimorfisme
• dacă sunt afectate gene care pot fi asociate cu fenotipul observat
• dacă sunt cunoscute cazuri cu aceeași aberație sau cu o aberație similară care prezintă un fenotip similar.

Cu cât mai multe matrice CGH vor fi utilizate în diagnosticul clinic, cu atât este mai probabil ca designul matricei să se adapteze la cerințele din acest domeniu: Evitând regiunile CNV cunoscute și favorizând regiunile cromozomiale și genele implicate în retardul mintal și în sindroamele dismorfice, matricele vor deveni din ce în ce mai interesante pentru diagnosticarea pre și postnatală.

Institutul nostru a stabilit cursul pentru a profita acum de tehnologia matricei și pentru a fi capabil să preia imediat evoluțiile viitoare. Am optat pentru echipamente tehnice care pot, de asemenea, să evalueze array-uri cu cea mai înaltă rezoluție în mod fiabil și reproductibil.

Contactați-ne dacă doriți să folosiți serviciile și experiența noastră în domeniul array CGH. Vom fi bucuroși să vă informăm cu privire la durata unei astfel de investigații, costurile și modelele de matrice care pot fi utilizate în prezent.

Referințe

Array CGH în retardul mintal

Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, Rio M, Willatt L, Fiegler H, Firth H, Sanlaville D, Winter R, Colleaux L, Bobrow M, Carter NP. Hibridizarea genomică comparativă bazată pe microarray (array-CGH) detectează deleții și duplicații cromozomiale submicroscopice la pacienții cu tulburări de învățare/retard mental și caracteristici dismorfice. J Med Genet. 2004 Apr;41(4):241-8.

de Vries BB, Pfundt R, Leisink M, Koolen DA, Vissers LE, Janssen IM, Reijmersdal S, Nillesen WM, Huys EH, Leeuw N, Smeets D, Sistermans EA, Feuth T, van Ravenswaaij-Arts CM, van Kessel AG, Schoenmakers EF, Brunner HG, Veltman JA. Profilarea genomului de diagnostic în retardul mintal. Am J Hum Genet. 2005 Oct;77(4):606-16.

Menten B, Maas N, Thienpont B, Buysse K, Vandesompele J, Melotte C, de Ravel T, Van Vooren S, Balikova I, Backx L, Janssens S, De Paepe A, De Moor B, Moreau Y, Marynen P, Fryns JP, Mortier G, Devriendt K, Speleman F, Vermeesch JR. Modele emergente de dezechilibre cromozomiale criptice la pacienții cu retard mental idiopatic și anomalii congenitale multiple: o nouă serie de 140 de pacienți și o analiză a literaturii de specialitate. J Med Genet. 2006.

Array-CGH in der Pränataldiagnostik

Rickman L, Fiegler H, Shaw-Smith C, Nash R, Cirigliano V, Voglino G, Ng BL, Scott C, Whittaker J, Adinolfi M, Carter NP, Bobrow M. Prenatal detection of unbalanced chromosomal rearrangements by array-CGH. J Med Genet. 2006 Apr;43(4):353-61.

Van den Veyver, IB; Beaudet AL. Hibridizarea genomică comparativă și diagnosticul prenatal. Curr Opin Obstet Obstet Gynecol 2006 (18): 185-191.

Die Bedeutung der CNVs (copy number variations) für die Array-CGH

Feuk L, Carson AR, Scherer SW. Variația structurală în genomul uman. Nat Rev Genet. 2006 Feb;7(2):85-97

2006 Feb;7(2):85-97.