Proteine fluorescente din A. victoria
Proprietățile spectrale ale GFP sau ale variantelor sale rezidă în structura aminoacizilor care formează cromoforul (Figura 1). Aceasta poate fi reprezentată de cei trei aminoacizi de la pozițiile 65-67 sau de reziduuri apropiate de această poziție (de exemplu, YFP). În afară de mutațiile principale privind cromoforul, s-au efectuat cercetări și asupra altor mutagenii dirijate la fața locului pentru a îmbunătăți alți factori, cum ar fi maturarea și exprimarea proteinei în sisteme celulare heterologe (de exemplu, utilizarea codonilor, plierea proteinei la temperatura fiziologică). Rețineți că A. victoria este un organism marin relativ primitiv, fără sistem de încălzire corporală.
Chiar dacă GFP este unul dintre cei mai populari FP datorită luminozității și fotostabilității sale ridicate, acesta are două dezavantaje principale. Acestea sunt o anumită sensibilitate la pH și o ușoară tendință de dimerizare. Dimerizarea sau oligomerizarea este o problemă a multor FP. Preferința lor de a se aglutina unul cu celălalt poate produce artefacte sau interpretări eronate în ceea ce privește localizarea și funcția proteinei fuzionate. Dar oamenii de știință au venit cu unele răspunsuri și la această problemă. Mutațiile în poziții critice (F223R, L221K și A206K) în care aminoacizii nepolari sunt înlocuiți cu cei hidrofili prezintă o dimerizare redusă. Toate modificările genetice care conduc la o îmbunătățire a caracteristicilor spectrale, dar și practice, sunt rezumate sub denumirea de FP „îmbunătățite”.
În cazul wtGFP, îmbunătățirile conduc la un EGFP (enhanced GFP) cu un singur vârf de excitație la 488 nm în loc de spectrul de absorbție complex anterior la 395 nm și 475 nm. Prima versiune mutantă a wtGFP (mutantul S65T) dezvoltată de Roger Tsien et al. a fost de cinci ori mai luminoasă decât cea originală și a prezentat un timp de maturare mai scurt. Împreună cu o eficiență mai bună a maturării la 37°C, bazată pe o altă mutație (F64L), acest lucru joacă un rol important pentru cei care privesc celulele vii.
O variantă GFP foarte interesantă cu una dintre cele mai mari deplasări Stokes este Sapphire. O mutație într-o poziție apropiată de cromofor (T203I) duce la o alterare a maximului de excitație la 399 nm și a maximului de emisie la 511 nm. Aceasta reprezintă o deplasare Stokes de 112 nm. Emerald este o altă modificare a GFP cu o fotostabilitate și luminozitate îmbunătățite și o pliere mai eficientă în celulele mamiferelor.
În timp ce toate proteinele fluorescente verzi au o luminozitate relativ mare, proteinele fluorescente albastre suferă în mod normal de o intensitate redusă a emisiei în aplicațiile microscopice. Cu toate acestea, ele sunt utilizate în testele optice datorită altor proprietăți spectrale. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) a fost construită prin mai multe runde de mutații ale wtGFP. Prima mutare (Y66H) a sărit vârful de emisie din spectrul verde în cel albastru. Au urmat alte mutații, producând o proteină cu un maxim de excitație la 380 nm și un maxim de emisie la 448 nm. Aceste proprietăți spectrale o fac să fie un partener pentru EGFP în microscopia FRET. Proteinele fluorescente albastre recente cu randamente cuantice mai mari și o mai bună fotostabilitate sunt Azurite, SBFP2 și EBFP2. Un succesor promițător al EBFP este o proteină numită Sirius, care a devenit populară datorită toleranței sale foarte ridicate la pH (stabilă de la pH 3-9) și reputației sale de a fi proteina fluorescentă cu cea mai scurtă lungime de undă de emisie de până acum.
O a doua clasă „albastră” de variante GFP este formată din proteinele fluorescente cian: CFP. Înlocuirea tirozinei cu triptofan (Y66W) și alte modificări genetice conduc la un fluorocrom cu luminozitate și fotostabilitate îmbunătățite. Această ECFP are un spectru de excitație și emisie bimodal la 433/445 nm și 475/503 nm. Luminozitatea este de numai aproximativ 40 % din cea a EGFP. O variantă proeminentă a ECFP este Cerulean, care are un coeficient de extincție și un randament cuantic mai mare. Este de 1,5 ori mai luminoasă decât ECFP și este utilizată ca partener FRET cu YFP.
O mutație GFP care nu modifică direct unul dintre cei trei aminoacizi centrali din cromofor a dus la creșterea proteinelor fluorescente galbene. YFP-urile au o treonină comună la poziția 203 care este schimbată cu o tirozină (T203Y). Acest aminoacid face parte din β-baril și se află în imediata apropiere a cromoforului. Comparativ cu GFP, proprietățile de excitație și emisie au fost deplasate către lungimi de undă mai mari, cu maxime de excitație și emisie la 514 nm și 527 nm (EYFP). O caracteristică a EYFP este sensibilitatea sa la pH. La pH 6,5, EYFP are doar aproximativ 50 % din fluorescența sa, ceea ce nu reprezintă întotdeauna un dezavantaj. Atunci când vine vorba de măsurarea pH-ului (de exemplu, a veziculelor, endosomilor etc.), EYFP poate fi utilizat ca indicator. Este interesant faptul că o altă mutație (Q69M) a dezvoltat o mai bună stabilitate acidă și a îmbunătățit dramatic luminozitatea (cu 75 % mai luminoasă decât EGFP). Această proteină, care are totuși o fotostabilitate slabă în comparație cu EGFP, a fost numită Citrine. Un alt mutant YFP (F46L) a arătat o viteză de maturare drastic mai rapidă și, de asemenea, o rezistență îmbunătățită la pH. Această proteină a fost numită Venus și este un acceptor FRET frecvent cu Cerulean.
.