- Ce să alegeți pentru studii de microbiom
- Ce este secvențierea genei 16S rRNA?
- Ce este secvențierea metagenomică shotgun?
- Secvențierea 16S/ITS vs. secvențierea 16S/ITS. shotgun metagenomic sequencing
- Rezoluția taxonomică
- Profilare funcțională
- Cuprinderea microbiană și tipul de eșantion recomandat
- False pozitive
- Interferența ADN-ului gazdă
- Intrare ADN
- Here to Help
- Descoperiți ce metodă de secvențiere este cea mai bună pentru dumneavoastră. Discutați cu experții care oferă serviciile de secvențiere ZymoBIOMICS.
Ce să alegeți pentru studii de microbiom
Secvențiere 16S sau secvențiere shotgun? Aproape toți cercetătorii din domeniul microbiomului își pun această întrebare atunci când planifică un nou studiu, deoarece marea majoritate a publicațiilor despre microbiom utilizează fie secvențierea genei 16S ARNr, fie secvențierea metagenomică shotgun pentru a genera date brute pentru profilarea microbiană ulterioară sau pentru analizele metagenomice. Fiecare metodă are avantajele și dezavantajele sale, așa că, ce metodă ar trebui să alegeți?
Ce este secvențierea genei 16S rRNA?
Secvențierea genei 16S rRNA, sau pur și simplu secvențierea 16S, utilizează PCR pentru a ținti și amplifica porțiuni din regiunile hipervariabile (V1-V9) ale genei bacteriene 16S rRNA1. Ampliconilor din probe separate li se atribuie apoi coduri de bare moleculare, se grupează împreună și se secvențiază. După secvențiere, datele brute sunt analizate cu ajutorul unui pipeline bioinformatic care include tunderea, corectarea erorilor și compararea cu o bază de date de referință 16S. După ce citirile sunt atribuite la un rang filogenetic, se poate genera un profil taxonomic. În mod similar, secvențierea ITS urmează aceeași strategie, dar vizând regiunea ITS (Internal transcribed spacer) care se găsește în genomurile fungice.
Ce este secvențierea metagenomică shotgun?
În mod diferit de secvențierea 16S, care vizează doar genele 16S rRNA, secvențierea metagenomică shotgun secvențiază tot ADN-ul genomic dat dintr-o probă. Fluxul de lucru pentru pregătirea bibliotecii este similar cu secvențierea obișnuită a întregului genom, inclusiv fragmentarea aleatorie și ligatura adaptorului. Un flux de lucru tipic pentru analiza taxonomică a datelor metagenomice shotgun include tăierea calității și compararea cu o bază de date de referință care cuprinde genomuri întregi (de exemplu, Kraken2 și Centrifuge3) sau gene marker selectate (MetaPhlAn4 și mOTU5) pentru a genera un profil taxonomic. Deoarece secvențierea metagenomică shotgun acoperă toate informațiile genetice dintr-o probă, datele pot fi utilizate pentru analize suplimentare, de exemplu, asamblarea și clasificarea metagenomică, profilarea funcțiilor metabolice și profilarea genelor de rezistență la antibiotice.
Secvențierea 16S/ITS vs. secvențierea 16S/ITS. shotgun metagenomic sequencing
Dacă studiul dvs. necesită analize genomice dincolo de profilarea taxonomică, cum ar fi analiza căilor metabolice, ar trebui să luați în considerare shotgun metagenomic sequencing datorită acoperirii genomice mai mari și a producției de date. În cazul în care profilarea compoziției este scopul principal al studiului, ambele tehnici au argumente pro și contra care trebuie luate în considerare (tabelul 1).
.
.
Rezoluția taxonomică
Rezoluția taxonomică a secvențierii 16S/ITS depinde de regiunile variabile vizate, de organismul în sine și de algoritmul de analiză a secvenței. În ultimii ani, unele metode de corecție a erorilor, de exemplu DADA26, au îmbunătățit în mod dramatic acuratețea și rezoluția taxonomică a acestei tehnici. Cu DADA2, rezoluția la nivel de specie pentru multe organisme care utilizează secvențierea 16S obișnuită este acum o realitate. Dar, în teorie, secvențierea metagenomică shotgun poate atinge o rezoluție la nivel de tulpină, deoarece poate acoperi toate variațiile genetice. Deși, în practică, acuratețea rezoluției la nivel de tulpină se confruntă încă cu provocări tehnice. Chiar și așa, secvențierea metagenomică shotgun realizează o rezoluție mai mare în comparație cu secvențierea 16S/ITS.
Profilare funcțională
Dacă analiza funcției metabolice este un obiectiv, majoritatea cercetătorilor vor trece rapid cu vederea secvențierea 16S și ITS. Dar, există unele instrumente care pot deduce funcția metabolică din datele taxonomice, de exemplu PICRUSt7. Dar, în general, secvențierea metagenomică shotgun este adesea utilizată atunci când este necesară realizarea profilului funcțional, datorită acoperirii suplimentare a genelor.
Cuprinderea microbiană și tipul de eșantion recomandat
Secvențierea shotgun examinează tot ADN-ul metagenomic, în timp ce secvențierea 16S secvențiază doar genele ARNr 16S, care suferă, de asemenea, de o acoperire incompletă a primerilor. În consecință, prima are o acoperire mai mare a domeniului transversal. Atunci, de ce Tabelul 1 denotă secvențierea 16S/ITS ca fiind mai bună în ceea ce privește acoperirea bacteriilor și ciupercilor? Acest lucru derivă din acoperirea speciilor din bazele de date de referință disponibile, deoarece predicția taxonomică a acestor abordări de secvențiere depinde în mare măsură de baza de date de referință utilizată. În prezent, acoperirea bazelor de date 16S/ITS este mult mai bună decât cea a bazelor de date ale genomului întreg. Acest lucru se datorează faptului că genomurile întregi ale microbilor asociați cu microbiomul uman sunt mult mai bine studiate decât genomurile microbilor asociați cu alte medii. Acesta este motivul pentru care se recomandă utilizarea secvențierii metagenomice shotgun pentru probele legate de microbiomul uman, cum ar fi fecalele și saliva, dacă profilarea taxonomiei este scopul principal.
În plus, secvențierea metagenomică are o dependență mai mare de baza de date de referință. De exemplu, dacă o bacterie nu are niciun reprezentant strâns înrudit în baza de date de referință 16S, ați putea să o identificați la un rang filogenetic superior sau ca bacterie necunoscută. Dar, în cazul secvențierii metagenomice shotgun, dacă o bacterie nu are o rudă apropiată (un genom din același gen) în baza de date de referință a genomului, este posibil să o ratați complet. De exemplu, ZymoBIOMICS Spike-in Control I conține doi microbiști străini de microbiomul uman (Imtechella halotolerans și Allobacillus halotolerans), ale căror genomuri nu erau disponibile anterior. Dacă îl introduceți într-o probă de materii fecale și îl secvențiați prin secvențiere shotgun, majoritatea pipeline-urilor bioinformatice le vor rata complet, cu excepția cazului în care adăugați manual aceste două genomuri în baza de date de referință. Pe de altă parte, dacă sunt analizate cu secvențiere 16S, acestea vor fi identificate datorită prezenței secvenței lor 16S în bazele de date de referință.
False pozitive
Instrumentele de corecție a erorilor, cum ar fi DADA2, nu numai că îmbunătățesc rezoluția taxonomică a secvențierii 16S/ITS, dar îmbunătățesc și precizia. Acest lucru este demonstrat atunci când se secvențiază ADN din comunitatea microbiană simulată (de exemplu, ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Toate secvențele 16S sunt recuperate fără erori în secvență, adică fără rezultate fals pozitive. Dar, în cazul secvențierii metagenomice shotgun, dacă nu există un genom perfect reprezentativ în baza de date de referință pentru un microb secvențiat, este probabil ca analiza bioinformatică să prezică existența mai multor genomuri „strâns legate”. Aceste genomuri strâns înrudite pot proveni de la specii diferite din același gen sau chiar din genuri diferite. De exemplu, să presupunem că există trei microbi strâns înrudiți, A, B și C, și că aceștia au în comun anumite secvențe. Specia A împarte unele secvențe doar cu B și alte secvențe doar cu C. Dacă baza de date de referință conține doar genomuri din B și C, atunci când A a fost secvențiat, bioinformatica va prezice că atât B, cât și C sunt prezente. De exemplu, atât A, cât și B ar putea fi tulpini de Escherichia coli, iar C este Salmonella enterica; secvențele pe care B și C le au în comun în mod unic pot proveni dintr-un transfer orizontal de gene, care este comun între microbii strâns înrudiți. Din acest motiv, secvențierea 16S/ITS este mai bună în ceea ce privește falsurile pozitive.
Interferența ADN-ului gazdă
Prezența unei cantități prea mari de ADN gazdă poate cauza amplificare nespecifică în procesul de pregătire a bibliotecilor de secvențiere 16S și ITS, dar impactul este controlabil prin ajustarea ciclurilor PCR și schimbarea primerilor. Pe de altă parte, interferența ADN-ului gazdă este o problemă mult mai dificilă pentru secvențierea metagenomică shotgun, chiar dacă costul secvențierii a scăzut dramatic. În funcție de tipul de probă, unele probe pot conține >99% ADN uman gazdă, ceea ce nu numai că mărește costul secvenței, dar introduce, de asemenea, incertitudine în măsurare. Acesta este motivul pentru care mulți cercetători se interesează de epuizarea ADN-ului gazdă, de exemplu HostZERO Microbial DNA Kit, înainte de pregătirea bibliotecii de secvențiere shotgun. Cu toate acestea, este posibil să nu rămână suficient ADN genomic microbian pentru secvențierea shotgun după epuizarea ADN-ului gazdă, care necesită, de obicei, un aport minim de 1ng. Interferența ADN-ului gazdă este motivul pentru care secvențierea shotgun de mică adâncime este recomandată numai pentru probele fecale umane.
Intrare ADN
În timp ce secvențierea metagenomică Shotgun necesită o intrare de ADN de minimum 1 ng, secvențierea 16S/ITS este mult mai sensibilă, minimele de intrare fiind de femtograme sau chiar de până la 10 copii ale genelor 16S ARNr.
Here to Help
Alegerea între secvențierea 16S și secvențierea metagenomică shotgun este un pas critic pentru toate studiile de microbiom. În plus față de buget, trebuie luate în considerare multe aspecte ale proiectului, inclusiv tipul de eșantion, analizele dorite, rezoluția taxonomică și organismele țintă. Luarea în considerare a acestor considerente vă va ajuta să alegeți metoda de secvențiere potrivită pentru următorul dumneavoastră proiect de microbiom. Serviciile de secvențiere a microbiomului de la ZymoBIOMICS oferă secvențierea 16S, ITS și shotgun ca servicii complete, de la extracția ADN-ului până la secvențiere și bioinformatică. Experții în secvențiere și bioinformatică de la Zymo Research sunt bucuroși să vă ajute să alegeți metoda de secvențiere potrivită pentru studiul dumneavoastră.
Descoperiți ce metodă de secvențiere este cea mai bună pentru dumneavoastră. Discutați cu experții care oferă serviciile de secvențiere ZymoBIOMICS.
Aflați mai multe
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Methodological Challenges and Opportunities (Provocări și oportunități metodologice). Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: clasificarea ultra-rapidă a secvențelor metagenomice folosind alinieri exacte. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: clasificarea rapidă și sensibilă a secvențelor metagenomice. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Profilarea comunității microbiene metagenomice folosind gene marker unice specifice cladelor. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomic species profiling using universal phylogenetic marker genes. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: Inferență de eșantionare de înaltă rezoluție din datele de amplicon Illumina. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
13 noiembrie 2019