Virus și celule
Dacă nu se indică altfel, toate experimentele au fost efectuate folosind un izolat clinic de virus gripal în celule MDCK A/Memphis/14/96-M (H1N1) furnizat cu amabilitate de Dr. Robert Webster (St. Jude Children’s Hospital, SUA). Virusurile descrise în Fig. 5 au fost furnizate cu amabilitate de către colegii enumerați în secțiunea „Acknowledgements”.
Celele MDCK și celulele MDCK-SIAT1 transfectate în mod stabil cu 2,6-sialiltransferaza pentru o mai bună exprimare a oligozaharidelor terminate cu Neu5Ac2-6Gal au fost descrise anterior . Am propagat ambele tipuri de celule în DMEM (Gibco) suplimentat cu 2 mM L-glutamină, 10% ser fetal de vițel și antibiotice (streptomicină, 100 mg/ml și penicilină, 100 U/ml).
Mediu de întreținere
Ca mediu lichid de întreținere (MM) pentru infecția cu virus, am folosit MEM Eagle’s care conține L-glutamină, 0,1% BSA (Sigma, A-0336), antibiotice și 1 μg/ml tripsină TPCK (Sigma, T-1426).
Stocuri de 1,8% Bacto-Agar (BD, 214010) și 2% metilceluloză (Methocel MC, 3000-5500 mPa.s la 2%, Fluka) în apă distilată au fost pregătite așa cum a fost descris anterior .
Producătorul de Avicel RC/CL (FMC BioPolymer) a avut amabilitatea de a furniza trei tipuri de Avicel (RC-581, RC-591 și CL-661) pentru testare. Am pregătit suspensii stoc de Avicel prin dispersarea a 2,4 g de pulbere Avicel în 100 ml de apă distilată pe un agitator magnetic standard timp de 1 oră. Rezervele de agar, MC și Avicel au fost sterilizate prin autoclavare timp de 20 de minute la 121°C și depozitate la temperatura camerei.
Suprapunerile au fost pregătite prin amestecarea soluțiilor stoc de MC, Avicel sau agar topit cu volume egale de mediu de întreținere de rezistență dublă. Pentru a varia concentrația de MC și Avicel din suprapuneri, am diluat stocurile originale cu apă sterilă. Suprapunerea pe bază de agar a fost preparată la 42-44°C, alte două suprapuneri au fost pregătite fie la 20, fie la 37°C.
Stocurile Avicel concentrate (2,4%) nu s-au separat de obicei în timpul depozitării, însă suprapunerile diluate pe bază de Avicel au fost mai puțin stabile. Dacă s-a considerat necesar, am amestecat stocurile Avicel și am amestecat întotdeauna suprapunerile Avicel înainte de utilizare, fie prin agitare cu mâna, fie prin vortexare. Separarea lentă a suprapunerilor după aplicarea lor pe monostraturile celulare nu a afectat rezultatele testelor.
Testul plăcilor în plăci cu 6 godeuri
La o oră după ce am infectat monostraturile celulare cu 30-50 de unități formatoare de plăci de virus în 1 ml de mediu de întreținere fără tripsină, am îndepărtat inoculul de virus, am acoperit celulele cu 3 ml din diferitele medii de suprapunere și am incubat culturile la 35°C în atmosferă de 5% CO2. În cazul suprapunerilor MC și Avicel, s-a avut grijă să nu se deranjeze plăcile în timpul perioadei de incubare pentru a evita formarea de plăci neuniforme. După trei zile de incubare, am îndepărtat suprapunerile și am fixat celulele. Suprapunerea de agar a fost îndepărtată cu ajutorul unei spatule metalice; suprapunerile de MC, Avicel și lichid au fost îndepărtate prin aspirare. Celulele au fost fixate cu soluție de paraformaldehidă 4% în MEM timp de 30 de minute la 4°C și au fost spălate cu PBS. Toate tratamentele ulterioare ale celulelor au fost efectuate la temperatura camerei. Am permeabilizat celulele și, simultan, am blocat grupările aldehidice reziduale prin incubarea celulelor timp de 10-20 min cu 1 ml/puț de soluție conținând 0,5 % Triton-X-100 și 20 mM glicină în PBS. Am imunocolorat celulele infectate cu virusuri prin incubare timp de 1 oră cu anticorpi monoclonali specifici pentru nucleoproteina virusului gripal A (cu amabilitate oferită de Dr. Alexander Klimov de la Centers for Disease Control, SUA), urmată de o incubare de 1 oră cu anticorpi anti-șoarece marcați cu peroxidază (DAKO, Danemarca) și de o incubare de 30 de minute cu substraturi de peroxidază care formează precipitate. Pentru prepararea diluțiilor de lucru ale imuno-reactivilor s-a utilizat o soluție de 10% ser de cal normal și 0,05% Tween-80 în PBS. Am spălat celulele după administrarea anticorpilor primari și secundari prin incubarea lor de trei ori timp de 3-5 min cu 0,05% Tween-80 în PBS. Ca substraturi de peroxidază, am folosit fie True Blue™ (KPL) gata de utilizare, fie o soluție de aminoetilcarbazol (AEC, Sigma) (0,4 mg/ml) preparată în soluție tampon de acetat de sodiu 0,05 M, pH 5,5 și conținând 0,03% H2O2. Plăcile colorate au fost spălate cu apă de la robinet pentru a opri reacția și uscate. În cazul colorării cu True Blue, care este relativ instabilă în soluțiile de apă, plăcile au fost uscate invers pentru a minimiza albirea. Plăcile colorate au fost scanate pe un scaner cu pat plat, iar datele au fost achiziționate cu ajutorul software-ului Adobe Photoshop 7.0.
Ca o alternativă la imunomarcație, în unele experimente am evidențiat plăcile ca zone de celule distruse. În acest scop, după îndepărtarea suprapunerilor, am colorat celulele cu soluție de cristal violet 1% în 20% metanol în apă.
Variante de titrare a virusului în plăci cu 96 de godeuri
1. Varianta standard
Am infectat monostraturi de celule MDCK sau MDCK-SIAT1 în plăci cu 96 de puțuri cu 50 μl/puț de diluții seriale ale virusului în mediul de întreținere fără tripsină. După 1 h de incubație la 35°C la 5% CO2, am eliminat virusul, am adăugat 100 μl/podiță de mediu de suprapunere MC sau Avicel și am incubat celulele timp de încă 24 h pentru a permite formarea plăcilor. Fixarea și imunocolorația au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus pentru plăcile cu 6 puțuri, dar folosind 50 μl de reactivi pe puț.
2. Varianta simplificată
S-a efectuat testul exact ca în varianta standard, cu următoarele modificări. După 1 h de incubație cu virusul, nu am îndepărtat inoculul. Am adăugat 100 μl/cuvă de mediu de suprapunere Avicel și am amestecat placa fie prin batere cu mâna, fie cu ajutorul unui mixer de plăci. Mediile au inclus cantități crescute de tripsină (1,5 μg/ml) pentru a compensa diluția stratului de suprapunere cu materialul care conține virusul prezent în godeuri.
Sensul de inhibiție a placentei
Noel Roberts (Roche Products, UK) a avut amabilitatea de a furniza inhibitorul de neuraminidază oseltamivir carboxilat (OC). Am adăugat 50 μl/cavitate de diluții seriale de 10 ori mai mari de OC în mediu de întreținere fără tripsină (interval de concentrație de la 4 nM la 400 μM OC) la monostraturi de celule MDCK-SIAT1 în plăci cu 96 de cavități. Am adăugat apoi 50 μl/poci de diluții de virus (20-40 de unități formatoare de plăci pe puț). Am amestecat placa și am incubat-o timp de 1 h la 35°C pentru a permite inițierea infecției virale. După aceea, am adăugat 100 μl/puț de mediu de suprapunere Avicel 1,2% care conține 2 μg/ml tripsină, am incubat culturile timp de 24 h și le-am fixat și imunocolorat așa cum am descris mai sus.
În cazul plăcilor cu 6 puțuri, am adăugat 0,75 ml de aliquotă de medicament și inhibitor și 1,5 ml de aliquotă de Avicel pe puț și am imunocolorat plăcile la 3 zile după infecție.
.