- ¿Qué elegir para los estudios del microbioma
- ¿Qué es la secuenciación del gen del ARNr 16S?
- ¿Qué es la secuenciación metagenómica Shotgun?
- Secuenciación 16S/ITS vs. secuenciación metagenómica shotgun
- Resolución taxonómica
- Perfiles funcionales
- Cobertura microbiana y tipo de muestra recomendada
- Falsos positivos
- Interferencia del ADN del huésped
- Entrada de ADN
- Estamos aquí para ayudar
- Averigüe qué método de secuenciación es el mejor para usted. Hable con los expertos que proporcionan los servicios de secuenciación de ZymoBIOMICS.
¿Qué elegir para los estudios del microbioma
Secuenciación 16S o secuenciación shotgun? Casi todos los investigadores del microbioma se hacen esta pregunta cuando planifican un nuevo estudio porque la gran mayoría de las publicaciones sobre el microbioma utilizan la secuenciación del gen del ARNr 16S o la secuenciación metagenómica de escopeta para generar datos en bruto para los posteriores análisis de perfiles microbianos o metagenómicos. Cada método tiene sus pros y sus contras, así que, ¿qué método debería elegir?
¿Qué es la secuenciación del gen del ARNr 16S?
La secuenciación del gen del ARNr 16S, o simplemente la secuenciación del 16S, utiliza la PCR para dirigir y amplificar porciones de las regiones hipervariables (V1-V9) del gen del ARNr 16S bacteriano1. Los amplicones de las distintas muestras reciben códigos de barras moleculares, se agrupan y se secuencian. Después de la secuenciación, los datos brutos se analizan con un proceso bioinformático que incluye el recorte, la corrección de errores y la comparación con una base de datos de referencia 16S. Después de asignar las lecturas a un rango filogenético, se puede generar un perfil taxonómico. Del mismo modo, la secuenciación ITS sigue la misma estrategia pero dirigida a la región ITS (Internal transcribed spacer) que se encuentra en los genomas de los hongos.
¿Qué es la secuenciación metagenómica Shotgun?
A diferencia de la secuenciación 16S, que sólo se dirige a los genes 16S rRNA, la secuenciación metagenómica Shotgun secuencia todo el ADN genómico dado de una muestra. El flujo de trabajo de la preparación de la biblioteca es similar al de la secuenciación regular del genoma completo, incluyendo la fragmentación aleatoria y la ligación de adaptadores. Un flujo de trabajo típico para el análisis taxonómico de los datos metagenómicos de escopeta incluye el recorte de calidad y la comparación con una base de datos de referencia que comprende genomas completos (por ejemplo, Kraken2 y Centrifuge3) o genes marcadores seleccionados (MetaPhlAn4 y mOTU5) para generar un perfil taxonómico. Dado que la secuenciación metagenómica de escopeta cubre toda la información genética de una muestra, los datos pueden utilizarse para análisis adicionales, por ejemplo, ensamblaje metagenómico y binning, perfil de función metabólica y perfil de genes de resistencia a los antibióticos.
Secuenciación 16S/ITS vs. secuenciación metagenómica shotgun
Si su estudio requiere análisis genómicos más allá del perfilado de la taxonomía, como el análisis de las vías metabólicas, debería considerar la secuenciación metagenómica shotgun debido a su mayor cobertura genómica y salida de datos. Si el perfil de composición es el objetivo principal del estudio, ambas técnicas tienen pros y contras que deben considerarse (Tabla 1).
Tabla 1: En general, la secuenciación metagenómica de escopeta tiene mayor resolución taxonómica, perfil funcional y cobertura de dominios cruzados. En todos los demás aspectos, incluidos el precio y la compatibilidad del origen de las muestras, la secuenciación 16S/ITS tiene ventaja.
Resolución taxonómica
La resolución taxonómica de la secuenciación 16S/ITS depende de las regiones variables a las que se dirige, del propio organismo y del algoritmo de análisis de la secuencia. En los últimos años, algunos métodos de corrección de errores, como el DADA26, han mejorado notablemente la precisión y la resolución taxonómica de esta técnica. Con DADA2, la resolución a nivel de especie para muchos organismos utilizando la secuenciación 16S regular es ahora una realidad. Pero, en teoría, la secuenciación metagenómica de escopeta puede alcanzar una resolución a nivel de cepa porque puede cubrir todas las variaciones genéticas. Aunque en la práctica, la precisión de la resolución a nivel de cepa sigue enfrentándose a retos técnicos. Aun así, la secuenciación metagenómica shotgun logra una mayor resolución en comparación con la secuenciación 16S/ITS.
Perfiles funcionales
Si el análisis de la función metabólica es un objetivo, la mayoría de los investigadores pasarán rápidamente por alto la secuenciación 16S e ITS. Sin embargo, existen algunas herramientas que permiten inferir la función metabólica a partir de datos taxonómicos, por ejemplo, PICRUSt7. Pero, en general, la secuenciación metagenómica de escopeta se utiliza a menudo cuando se requiere la elaboración de perfiles funcionales debido a la cobertura genética adicional.
Cobertura microbiana y tipo de muestra recomendada
La secuenciación de escopeta examina todo el ADN metagenómico mientras que la secuenciación 16S sólo los genes 16S rRNA, que también sufre de una cobertura de cebadores incompleta. En consecuencia, la primera tiene una mayor cobertura de dominios cruzados. Entonces, ¿por qué la Tabla 1 indica que la secuenciación 16S/ITS es mejor en la cobertura de bacterias y hongos? Esto se debe a la cobertura de especies de las bases de datos de referencia disponibles, ya que la predicción taxonómica de estos enfoques de secuenciación depende en gran medida de la base de datos de referencia utilizada. Actualmente, la cobertura de las bases de datos 16S/ITS es mucho mejor que la de las bases de datos del genoma completo. Esto se debe a que los genomas completos de los microbios asociados al microbioma humano están mucho mejor estudiados que los genomas de los microbios asociados a otros entornos. Por eso se recomienda utilizar la secuenciación metagenómica de escopeta para las muestras relacionadas con el microbioma humano, como las heces y la saliva, si el objetivo principal es el perfil taxonómico.
Además, la secuenciación metagenómica tiene una mayor dependencia de la base de datos de referencia. Por ejemplo, si una bacteria no tiene ningún representante estrechamente relacionado en la base de datos de referencia 16S, se podría identificar en un rango filogenético superior o como una bacteria desconocida. Pero, en el caso de la secuenciación metagenómica de escopeta, si una bacteria no tiene un pariente cercano (un genoma del mismo género) en la base de datos del genoma de referencia, es probable que se pierda por completo. Por ejemplo, el ZymoBIOMICS Spike-in Control I contiene dos microbios ajenos al microbioma humano (Imtechella halotolerans y Allobacillus halotolerans), cuyos genomas no estaban disponibles anteriormente. Si se espolvorea en una muestra fecal y se secuencia con secuenciación shotgun, la mayoría de los pipelines bioinformáticos los pasarán por alto por completo, a menos que se añadan manualmente estos dos genomas a la base de datos de referencia. Por otro lado, si se analizan con secuenciación 16S, se identificarán debido a la presencia de su secuencia 16S en las bases de datos de referencia.
Falsos positivos
Las herramientas de corrección de errores, como DADA2, no sólo mejoran la resolución taxonómica de la secuenciación 16S/ITS, sino que también mejoran la precisión. Esto se demuestra al secuenciar el ADN de la comunidad microbiana simulada (por ejemplo, ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Todas las secuencias 16S se recuperan sin errores en la secuencia, es decir, sin falsos positivos. Pero, con la secuenciación metagenómica de escopeta, a menos que haya un genoma representativo perfecto en la base de datos de referencia para un microbio secuenciado, es probable que el análisis bioinformático prediga la existencia de múltiples genomas «estrechamente relacionados». Estos genomas estrechamente relacionados pueden ser de diferentes especies del mismo género o incluso de géneros diferentes. Por ejemplo, supongamos que hay tres microbios estrechamente relacionados, A, B y C, y que comparten algunas secuencias en común. La especie A comparte algunas secuencias sólo con B y otras sólo con C. Si la base de datos de referencia sólo contiene genomas de B y C, cuando se secuencie A, la bioinformática predecirá que tanto B como C están presentes. Por ejemplo, tanto A como B podrían ser cepas de Escherichia coli y C es Salmonella enterica; las secuencias que comparten únicamente B y C pueden proceder de una transferencia horizontal de genes, que es común entre microbios estrechamente relacionados. Debido a esto, la secuenciación 16S/ITS es mejor con respecto a los falsos positivos.
Interferencia del ADN del huésped
La presencia de demasiado ADN del huésped puede causar una amplificación no específica en el proceso de preparación de la biblioteca de la secuenciación 16S e ITS, pero el impacto es controlable ajustando los ciclos de PCR y cambiando los cebadores. Por otro lado, la interferencia del ADN del huésped es un problema mucho más difícil para la secuenciación metagenómica de escopeta, aunque el coste de la secuenciación ha disminuido drásticamente. Dependiendo del tipo de muestra, algunas muestras pueden contener >99% de ADN humano del huésped, lo que no sólo aumenta el coste de la secuencia sino que también introduce incertidumbre en la medición. Por ello, muchos investigadores buscan el agotamiento del ADN del huésped, por ejemplo, el kit de ADN microbiano HostZERO, antes de la preparación de la biblioteca de secuenciación shotgun. Sin embargo, es posible que no quede suficiente ADN genómico microbiano para la secuenciación por escopeta después del agotamiento del ADN del huésped, que suele requerir una entrada mínima de 1ng. La interferencia del ADN del huésped es la razón por la que la secuenciación de escopeta poco profunda sólo se recomienda para las muestras fecales humanas.
Entrada de ADN
Mientras que la secuenciación metagenómica de escopeta requiere una entrada de ADN de 1 ng como mínimo, la secuenciación de 16S/ITS es mucho más sensible, con mínimos de entrada que son femtogramos o incluso tan bajos como 10 copias de genes de ARNr 16S.
Estamos aquí para ayudar
La elección entre la secuenciación 16S y la secuenciación metagenómica shotgun es un paso crítico para todos los estudios del microbioma. Además del presupuesto, hay que tener en cuenta muchos aspectos del proyecto, como el tipo de muestra, los análisis deseados, la resolución taxonómica y los organismos objetivo. Tener en cuenta estas consideraciones le ayudará a elegir el método de secuenciación adecuado para su próximo proyecto sobre el microbioma. Los servicios de secuenciación del microbioma de ZymoBIOMICS ofrecen servicios completos de secuenciación 16S, ITS y shotgun, desde la extracción del ADN hasta la secuenciación y la bioinformática. Los expertos en secuenciación y bioinformática de Zymo Research estarán encantados de ayudarle a elegir el método de secuenciación adecuado para su estudio.
Averigüe qué método de secuenciación es el mejor para usted. Hable con los expertos que proporcionan los servicios de secuenciación de ZymoBIOMICS.
Más información
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13 de noviembre de 2019