- Vad ska man välja för mikrobiomstudier
- Vad är 16S rRNA-gensekvensering?
- Vad är Shotgun Metagenomic Sequencing?
- 16S/ITS-sekvensering vs. shotgun metagenomisk sekvensering
- Taxonomisk upplösning
- Funktionsprofilering
- Mikrobiell täckning och rekommenderad provtyp
- Falskt positiva
- Värddjurs-DNA-interferens
- DNA-insats
- Här för att hjälpa
- Finn ut vilken sekvenseringsmetod som är bäst för dig. Prata med experterna som tillhandahåller ZymoBIOMICS sekvenseringstjänster.
Vad ska man välja för mikrobiomstudier
16S-sekvensering eller shotgun-sekvensering? Nästan alla mikrobiomforskare ställer sig denna fråga när de planerar en ny studie eftersom den stora majoriteten av mikrobiompublikationer använder antingen 16S rRNA-gensekvensering eller shotgun metagenomisk sekvensering för att generera rådata för efterföljande mikrobiell profilering eller metagenomiska analyser. Varje metod har sina för- och nackdelar, så vilken metod ska du välja?
Vad är 16S rRNA-gensekvensering?
16S rRNA-gensekvensering, eller helt enkelt 16S-sekvensering, använder PCR för att rikta in sig på och amplifiera delar av de hypervariabla regionerna (V1-V9) av bakteriens 16S rRNA-gen1. Amplikoner från separata prover förses sedan med molekylära streckkoder, sammanförs och sekvenseras. Efter sekvenseringen analyseras rådata med en bioinformatisk pipeline som omfattar trimning, felkorrigering och jämförelse med en 16S-referensdatabas. Efter att läsningarna har tilldelats en fylogenetisk rang kan en taxonomiprofil genereras. På samma sätt följer ITS-sekvensering samma strategi men riktar sig mot ITS-regionen (Internal transcribed spacer) som finns i svampgenom.
Vad är Shotgun Metagenomic Sequencing?
Till skillnad från 16S-sekvensering, som endast riktar sig mot 16S rRNA-gener, sekvenserar Shotgun Metagenomic Sequencing allt givet genomiskt DNA från ett prov. Arbetsflödet för framställning av bibliotek liknar den vanliga sekvenseringen av hela genomet, inklusive slumpmässig fragmentering och adapterligering. Ett typiskt arbetsflöde för taxonomianalys av metagenomiska shotgun-data innefattar kvalitetstrimning och jämförelse med en referensdatabas som omfattar hela genomer (t.ex. Kraken2 och Centrifuge3) eller utvalda markörgener (MetaPhlAn4 och mOTU5) för att generera en taxonomiprofil. Eftersom metagenomisk shotgun-sekvensering täcker all genetisk information i ett prov kan data användas för ytterligare analyser, t.ex. metagenomisk sammansättning och binning, profilering av metaboliska funktioner och profilering av antibiotikaresistensgener.
16S/ITS-sekvensering vs. shotgun metagenomisk sekvensering
Om din studie kräver genomiska analyser utöver taxonomiprofilering, t.ex. analys av metaboliska vägar, bör du överväga shotgun metagenomisk sekvensering på grund av dess större genomiska täckning och datautgång. Om sammansättningsprofilering är studiens huvudsyfte har båda teknikerna för- och nackdelar som bör övervägas (tabell 1).
Taxonomisk upplösning
Den taxonomiska upplösningen av 16S/ITS-sekvensering beror på de variabla regioner som man riktar in sig på, själva organismen och algoritmen för sekvensanalys. På senare år har vissa felkorrigeringsmetoder, t.ex. DADA26, dramatiskt förbättrat noggrannheten och taxonomiupplösningen för denna teknik. Med DADA2 är upplösning på artnivå för många organismer med hjälp av vanlig 16S-sekvensering nu en realitet. Men i teorin kan man med metagenomisk sekvensering med shotgun-teknik uppnå upplösning på stamnivå eftersom den kan täcka in alla genetiska variationer. Även om noggrannheten för upplösning på stamnivå i praktiken fortfarande står inför tekniska utmaningar. Trots detta uppnår shotgun metagenomisk sekvensering högre upplösning jämfört med 16S/ITS-sekvensering.
Funktionsprofilering
Om analys av metabolisk funktion är ett mål kommer de flesta forskare snabbt att förbise 16S- och ITS-sekvensering. Men det finns vissa verktyg som kan härleda metabolisk funktion från taxonomidata, t.ex. PICRUSt7. Men i allmänhet används ofta shotgun-metagenomsekvensering när funktionsprofilering krävs på grund av den extra gentäckningen.
Mikrobiell täckning och rekommenderad provtyp
Shotgun-sekvensering undersöker allt metagenomiskt DNA medan 16S-sekvensering endast undersöker 16S rRNA-gener, som också lider av ofullständig primertäckning. Följaktligen har den förstnämnda en större täckning över olika domäner. Varför anges då i tabell 1 att 16S/ITS-sekvensering är bättre när det gäller täckning av bakterier och svampar? Detta beror på arttäckningen i tillgängliga referensdatabaser, eftersom taxonomiprediktionen för dessa sekvenseringsmetoder i hög grad beror på vilken referensdatabas som används. För närvarande är täckningen i 16S/ITS-databaser mycket bättre än i helgenomdatabaser. Detta beror på att hela genomet hos mikrober som är associerade med människans mikrobiom är mycket bättre studerat än genomet hos mikrober som är associerade med andra miljöer. Det är därför som det rekommenderas att använda metagenomisk sekvensering med shotgun-teknik för prover med anknytning till människans mikrobiom, t.ex. avföring och saliv, om taxonomiprofilering är huvudsyftet.
Metagenomisk sekvensering har dessutom ett större beroende av referensdatabasen. Om en bakterie till exempel inte har någon närbesläktad representant i 16S-referensdatabasen kan man kanske identifiera den på en högre fylogenetisk rang eller som en okänd bakterie. Men när det gäller metagenomisk sekvensering med shotgun-teknik, om en bakterie inte har någon nära släkting (ett genom från samma släkte) i referensgenomdatabasen, är det troligt att du missar den helt och hållet. ZymoBIOMICS Spike-in Control I innehåller till exempel två mikrober som är främmande för det mänskliga mikrobiomet (Imtechella halotolerans och Allobacillus halotolerans), vars genomer tidigare inte var tillgängliga. Om du spikar in den i ett avföringsprov och sekvenserar med shotgun-sekvensering kommer de flesta bioinformatiska pipelines att missa dem helt och hållet om du inte manuellt lägger till dessa två genomer i referensdatabasen. Om de däremot analyseras med 16S-sekvensering kommer de att identifieras på grund av att deras 16S-sekvens finns i referensdatabaser.
Falskt positiva
Verktyg för felkorrigering, som till exempel DADA2, förbättrar inte bara taxonomiupplösningen av 16S/ITS-sekvensering, utan de förbättrar också noggrannheten. Detta har visats vid sekvensering av DNA från ett mock-mikrobiellt samhälle (t.ex. ZymoBIOMICS Microbial Community Standard). Alla 16S-sekvenser återfinns utan fel i sekvensen, dvs. inga falskt positiva. Men när det gäller metagenomisk sekvensering med shotgun-teknik är det troligt att den bioinformatiska analysen förutspår förekomsten av flera ”närbesläktade” genomer, om det inte finns ett perfekt representativt genom i referensdatabasen för en mikrob som sekvenseras. Dessa nära besläktade genomer kan komma från olika arter av samma släkte eller till och med från olika släkten. Anta till exempel att det finns tre närbesläktade mikrober, A, B och C, och att de har vissa sekvenser gemensamt. Art A delar vissa sekvenser endast med B och vissa andra sekvenser endast med C. Om referensdatabasen endast innehåller genomer från B och C, när A sekvenserades, kommer bioinformatiken att förutsäga att både B och C förekommer. Till exempel kan både A och B vara stammar av Escherichia coli och C är Salmonella enterica. De sekvenser som endast delas av B och C kan härröra från en horisontell genöverföring, vilket är vanligt mellan närbesläktade mikrober. På grund av detta är 16S/ITS-sekvensering bättre när det gäller falskt positiva resultat.
Värddjurs-DNA-interferens
Närvaron av för mycket värddjurs-DNA kan orsaka ospecifik amplifiering i biblioteksförberedelseprocessen för 16S- och ITS-sekvensering, men påverkan är kontrollerbar genom att justera PCR-cyklerna och byta primers. Å andra sidan är interferensen av värd-DNA ett mycket svårare problem för metagenomisk sekvensering med shotgun-teknik, även om kostnaden för sekvensering har minskat dramatiskt. Beroende på provtypen kan vissa prover innehålla >99 % mänskligt värd-DNA, vilket inte bara ökar sekvenskostnaden utan också medför osäkerhet i mätningen. Detta är anledningen till att många forskare undersöker hur man kan ta bort värd-DNA, t.ex. med HostZERO Microbial DNA Kit, innan man förbereder biblioteket för shotgun-sekvensering. Det kan dock hända att det inte finns tillräckligt med mikrobiellt genomiskt DNA kvar för shotgun-sekvensering efter utarmning av värd-DNA, som vanligtvis kräver en minsta mängd på 1ng. Interferensen av värd-DNA är anledningen till att ytlig shotgun-sekvensering endast rekommenderas för avföringsprover från människor.
DNA-insats
Medans Shotgun metagenomisk sekvensering kräver minst 1 ng DNA-insats är 16S/ITS-sekvensering mycket känsligare med insatsminimum som är femtogram eller till och med så lågt som 10 kopior av 16S rRNA-gener.
Här för att hjälpa
Valet mellan 16S-sekvensering och shotgun metagenomisk sekvensering är ett kritiskt steg för alla mikrobiomstudier. Förutom budgeten måste många aspekter av projektet beaktas, bland annat provtyp, önskade analyser, taxonomisk upplösning och målorganismer. Om du tar hänsyn till dessa överväganden kan du lättare välja rätt sekvenseringsmetod för ditt nästa mikrobiomprojekt. ZymoBIOMICS mikrobiomsekvenseringstjänster erbjuder 16S-, ITS- och shotgun-sekvensering som kompletta tjänster från DNA-extraktion till sekvensering och bioinformatik. Sekvenserings- och bioinformatik-experterna på Zymo Research hjälper dig gärna att välja rätt sekvenseringsmetod för din studie.
Finn ut vilken sekvenseringsmetod som är bäst för dig. Prata med experterna som tillhandahåller ZymoBIOMICS sekvenseringstjänster.
Läs mer
1. Laudadio I, Fulci V, Stronati L, Carissimi C. Next-Generation Metagenomics: Metodologiska utmaningar och möjligheter. Omics a Journal of Integrative Biology 2019 23(7): 327-333.
2. Wood DE, Salzberg SL. Kraken: ultrasnabb metagenomisk sekvensklassificering med hjälp av exakta anpassningar. Genome Biology 2014 15(3): R46.
3. Kim D, Song L, Breitwieser FP, Salzberg SL. Centrifuge: snabb och känslig klassificering av metagenomsekvenser. Genome Research 2016 26(12): 1721-1729.
4. Segata N, Waldron L, Ballarini A, Narasimhan V, Jousson O, Huttenhower C. Metagenomisk mikrobiell samhällsprofilering med hjälp av unika klasspecifika markörgener. Nature Methods 2012 9(8): 811-814.
5. Sunagawa S, et al. Metagenomisk artprofilering med hjälp av universella fylogenetiska markörgener. Nature Methods 2013 10(12): 1196-1199.
6. Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJA, Holmes SP. DADA2: Högupplöst provinferens från amplikondata från Illumina. Nature Methods 2016 13(7): 581-583.
7. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA, Clemente JC, Burkepile DE, Vega Thurber RL, Knight R, Beiko RG, Huttenhower C. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology 2013 31(9): 814-821.
13 november 2019