Analys och beskrivning av stadierna i Aspergillus fumigatus biofilmsbildning med hjälp av svepelektronmikroskopi

Med medicinskt sett är Aspergillus fumigatus en opportunistisk patogen hos personer med nedsatt immunförsvar, vars sjukdomsgrad beror på värdens immunförsvar, och som uppvisar en mortalitetsgrad på 50-95 %. Denna svamp ger upphov till lokala infektioner, t.ex. nageldermatomykoser eller svampkeratit, och till invasiva infektioner, t.ex. aspergillos, och utgör den näst vanligaste orsaken till svampinfektioner hos sjukhusvårdade patienter. A. fumigatus-infektioner i luftvägarna kan orsaka svamp i lungorna, invasiv aspergillos, invasiv pulmonell aspergillos (IPA), överkänslighetspneumonit, astma, immunglobulin E-medierad allergisk rinit, kronisk nekrotiserande lunginflammation eller allergisk bronkopulmonell aspergillos (ABPA). Dessutom ger den upphov till osteomyelit och endokardit.

A. fumigatus utvecklar en biofilm som kan vara en av de viktigaste virulensfaktorerna . A. fumigatus biofilm utarbetar mycelier inbäddade i en EMC in vitro, och biofilmsbildning har beskrivits i humana bronkiella epitelceller (HBE) och cystisk fibros bronkiella epitelceller (CFBEC) och hos patienter med cystisk fibros . Svampbiofilmbildning på katetrar och proteser bidrar till utvecklingen av nosokomiala infektioner. Därför förekommer persistens av svampinfektioner på grund av svampens förmåga att bilda biofilmer på en mängd olika medicintekniska produkter och på grund av att de persisterande cellerna utgör en viktig resistensmekanism. Behandlingen av en etablerad biofilm i värden kräver vanligen administrering av toxiska koncentrationer av antimikrobiella medel, och den rekommenderade behandlingen omfattar avlägsnande av den smittade anordningen. Därför är svampbiofilmer ett stort kliniskt och ekonomiskt problem .

Under det senaste decenniet har flera studier publicerats om A. fumigatus’ biofilm, både in vivo (i murinmodeller, hos patienter med invasiv lungaspergillos och i primära humana epitelkulturer) och in vitro (på polystyrenplattor). I allmänhet omfattar dessa studier huvudsakligen biofilmens mognadsstadium och ECM:s kemiska sammansättning, med få bilder av biofilmstadierna, men någon av dessa studier beskrev alla biofilmsbildningsstadier. Informationen skiljer sig således från de bidrag som gjorts av vår arbetsgrupp .

De viktigaste bidragen i denna studie är följande: i) Vi ger en beskrivning av alla stadier i biofilmsbildningen av A. fumigatus in vitro, över tid, och stegen stöds med SEM-bilder. ii) Vi analyserade två olika ursprung av isolat: ett från miljön och ett från en patient med hornhinnesår. iii) Vi rapporterar mikrohyphae (kliniskt isolat) och svampstrukturer som knappt har rapporterats hittills och som inte har beskrivits, såvitt vi känner till, för Aspergillus-arter. iv) Vi ger en beskrivning av spridningssteget för bildandet av biofilmskolonisation på nya punkter.

För att analysera den strukturella organisationen av den mogna biofilmen hos A. fumigatus (24 timmars inkubation vid 28 °C och 37 °C) undersöktes två stammar, en från jorden och en från en patient med svampkeratit, med SEM. En översikt över den biofilmsbildning av A. fumigatus som observerades i denna forskning var att dessa biofilmer uppförde sig på samma sätt oavsett om isolatet kom från jorden eller från kliniken, men det fanns skillnader beroende på inkubationstemperaturen. Vid 28 °C uppvisade biofilmen stadier som liknade dem som beskrivs i klassisk mikrobiell tillväxt: fördröjnings-, exponentiell och stationär fas; biofilmstillväxten var långsam och stabil med en låg ECM-produktion, och svampens strukturella organisation var enkel (fig. 1). Vid 37 °C visade prestandakurvan en ganska varierande fördröjningsfas (anpassning) och logfas (exponentiell fas), vilket kan vara ett svar på stress på grund av inkuberingen vid hög temperatur. Vid 37 °C minskar alltså anpassningsfasen (fördröjning) för att bibehålla en livskraftig svamp, och logfasen, med en diskontinuerlig ökning och med båda beteendena, är troligen ett anpassningsrespons . Vid 37 °C under mognadsstadiet fanns det således extremt organiserade mycelstrukturer, och dessa var reducerade och komprimerade med hyfer som var förtjockade och sammansmälta till anastomoser, och ECM var rikligt förekommande i sin täckande, omgivande och förstärkande svampstrukturer (fig. 3 och 4).

I den här studien ger vi bevis för A. fumigatus biofilmstadier genom SEM. De stadier som observerades under biofilmsbildningen var följande:

Adherence, cellkoaggregering och EPS-produktion

I ett tidigt skede (Fig. 2/4 h) fäster konidier vid plattans yta genom en interaktion av elektrostatiska krafter mellan svampens cellväggs strukturella komponenter, och denna attraktionskraft är svag och därför reversibel. Irreversibel och permanent bindning har i stor utsträckning beskrivits i specifika bakteriella adhesiner som finns på cellytan och som binder till substratet och EPS, som är ämnen som produceras av mikroorganismen i de inledande skedena av biofilmsbildningen och som fungerar som vidhäftning av cellerna till varandra och till substratet, och som består av protein- och kolhydratkomplex och glykoproteiner som huvudsakligen har strukturella eller vidhäftande funktioner. Adhesiner är involverade i erkännandet av bakterieceller sinsemellan, inklusive byggandet av broar och initiering av kolonibildning . Adhesiner beskrivs vid adhesion av svampar under biofilmsbildning. I biofilmer av Candida albicans, Candida glabrata och Candida tropicalis finns det en grupp adhesionsgener som är inblandade i biofilmsbildningen och som tillhör familjen agglutininliknande sekvenser (ALS), som spelar en nyckelroll i denna process och kodar för proteiner som har egenskaperna hos adhesinglykoproteiner på cellytan. ALS-familjen i C. albicans omfattar åtta gener (ALS1-ALS7 och ALS9) som kodar för många ytglykoproteiner. Hos A. fumigatus har sex hydrofobiner, som består av stavarna RodAp, RodBp, RodCp, RodDp, RodEp och RodFp, identifierats på konidiernas yta. Denna hydrofoba egenskap möjliggör vidhäftning till värdcellernas proteiner, och de kan vara inblandade i vidhäftningen till polystyrenplattans yta och initiera biofilmsbildningen i alla eller endast två eller tre av dessa . Dessutom beskrev Gravelat och medarbetare denna svampinteraktion, och de fann att adhesin MedA kontrollerar vidhäftningen till polystyrenplattan, biofilmsbildningen och uttrycket av konidieringsgener och att den har hårda effekter på konidieringsprocessen hos A. fumigatus . Vidhäftning, som är ett resultat av interaktionen mellan svampens adhesiner och plattans yta, och vidhäftning conidium-conidium utlöser troligen signalering och främjar cellkoaggregering och EPS-produktion, och dessa händelser presenteras i fig. 2 (4 h). Samtidigt påskyndar EPS svampens kolonibildning genom den täta bindningen av cellerna (Fig. 2 (8-12 h)) .

Konidiegroning till hyfer och utveckling

Biofilmsbildning kräver ett tröskelantal celler för att de ska kunna bli avlyssnade och generera ett svar, vilket är en regleringsmekanism för genuttryck med specifika funktioner . Vid biofilmsbildning hos A. fumigatus är konidieytan, innan den börjar grodda, tydligt hydrofob och består till 40 % av hydrofoba metylgrupper. Konidiespridningen hos A. fumigatus leder till att det hydrofoba skiktet av proteinhaltiga stänglar bryts upp och avslöjar inre konidieväggar som i huvudsak består av polysackarider, som är hydrofila cellväggskomponenter. Det finns en hydrofob spets på en enskild groddsporre. Konidiet förlorar successivt sin hydrofobicitet på ytan och därefter uppvisar den nya tillväxtspetsen en samexistens av hydrofoba stavar och hydrofila polysackarider . Konidiernas groning till hyfer börjar med bildning av groddrör, vilket illustreras i figur 2 (8-12 timmar), som har cellväggens mycket hydrofila karaktär, och de förväntas gynna hyfernas tillväxt .

Biofilmsmognad

A. fumigatus biofilmsmognad observerades vid 24 timmar, vilket är en inkubationstid som liknar de som rapporterats av andra forskare. De strukturella komponenterna omfattar ECM, som finns i den mogna biofilmen och binder cellerna för att bilda biofilmens strukturella bas, inklusive EPS och många organiserade mycelier (Fig. 2 (24 h0) . ECM. Vatten utgör den vanligaste beståndsdelen och är i biofilmen nästan 97 %. I denna fuktiga miljö finns ett ordnat makromolekylärt nätverk. De viktigaste funktionerna som beskrivs för EPS i bakteriella biofilmer är följande: vidhäftning, cellaggregation, kohesion, vattenhållning, en skyddande barriär som specifika värdförsvar eller antimikrobiella medel, absorption av organiska föreningar och oorganiska joner, enzymatisk aktivitet, näringskälla, utbyte av genetisk information, elektrondonator eller -acceptor, export av cellkomponenter, lagring av överskottsenergi, lagring av energi och stabilisering av enzymer . I svampbiofilmer är alla dessa funktioner ännu inte beskrivna, men några av dem håller på att studeras: matrisens sammanhållande och adhesiva krafter bidrar till biofilmens arkitektoniska och mekaniska stabilitet. Svampcellerna är immobiliserade i matrisen och fungerar som ett fungerande ekosystem som kontinuerligt förändras och regleras homeostatiskt med intensiva interaktioner, inklusive cell-cellkommunikation, som fungerar som det lim som håller ihop cellerna . Biofilmens struktur varierar kraftigt beroende på vilken mikroorganism som producerar den och de förhållanden som omger dess mikrohabitat, inklusive de strukturella skillnader som är förknippade med den kliniska presentationen. Under de infektiösa processerna stöder ECM skyddet mot värden och mikroorganismernas motståndskraft mot läkemedel. ECM är alltså inte bara en mekanisk ram utan också en regulator av cellbeteendet. Matrisens hydrofoba proteiner är bundna till specifika receptorer på cellytan som resulterar i cell-matris-adhesion, vilket utövar en effekt på cellform, migration, proliferation, cellöverlevnad och metabolism. Dessutom skyddar ECM cellerna mot miljöangrepp, inklusive torkning, ultraviolett (UV), strålning, oxidation, svält, rovdjurens verkan och värdens immunförsvar och antibiotika . ECM-egenskaperna var tydliga i fig. 2 (24 timmar) och fig. 3 och de fastnade vid svamphyferna i en sammanhängande hölje och observerades också med en porös konsistens (fig. 2 (24 timmar)). I A. fumigatus biofilm var EPS mycket strukturellt arrangerad och hade en riklig produktion, som täckte, omgav och förstärkte svampstrukturerna; den fungerar som ett sammanhållande medel för sammansmältning av hyphae-hyphae-strukturer (endast 37 °C). EPS uppträder med ett slemmigt utseende som helt och hållet fäster och täcker hyferna, vilket orsakar anastomos och stänger vattenkanalernas lumen (fig. 2 (24 h), 3 och 4). I tidigare studier har vår arbetsgrupp beskrivit A. fumigatus biofilms mognadsstadium, där liknande strukturer observerades .

I vissa mikrokonsortier är den kemiska sammansättningen av EPS känd (kolhydratpolymerer, DNA och/eller proteiner och, lipider, bland annat) men andra återstår att identifiera. A. fumigatus’-ytan består av α-1,3-glukaner, kitin, kitosan, galaktomannan, galaktosaminogalaktan, melanin och proteiner. Cellväggens sammansättning och strukturella organisation ommöbleras ständigt; även om de närvarande polysackariderna är desamma varierar deras mängd och lokalisering med tillväxtförhållandena och näringsmiljön. Här visade vi den kemiska sammansättningen av A. fumigatus biofilm, vilket observerades genom samlokalisering av fluorokromer som är knutna till kitin, metabolisk aktivitet och nukleinsyror med CLSM; dessutom observerades överlappning av fluorokromsignalerna när dessa knöts till två eller tre av dessa (fig. 5). Den funktion som beskrevs för polysackarider, t.ex. α 1,3-glukaner, omfattade att de spelar en dominerande roll in vitro i hyferaggregationen och i hyferaggregationen i biofilmer. Andra polysackarider i ECM, inklusive galaktomannan och galaktosaminogalaktan, är också kända för att ha en roll i skyddet av svampen och i vidhäftningen av dess biofilmstrukturer till ytor . Extracellulärt DNA (eDNA) är en viktig komponent i ECM-biofilmen som upprätthåller den strukturella och arkitektoniska integriteten hos A. fumigatus. eDNA bildas genom autolys och har i betydande grad förknippats med nivåerna av svampresistens (fig. 5). Dessutom kan eDNA vara en reservoar för gener för horisontell genöverföring. DNA ger en fastare och mer motståndskraftig strukturell organisation när det är samlokaliserat med polysackarider. eDNA kommer från svampceller på grund av att A. fumigatus utsöndrar chitinaser som gynnar dess frisättning (fig. 5) . I biofilm utövar cellväggsmodifiering en väsentlig inverkan på resistensen mot cellväggsläkemedel. I A. fumigatus, i en biofilmsmodell för mus, i multidrug-resistenta (MDR) utflödespumpar AfuMDR4-gener som är associerade med utflödet av antimikrobiella medel, inducerades genen signifikant av behandling med vorikonazol efter 24 timmar . FUN1-markören avslöjade metabolisk aktivitet som är ett levande samhälle (fig. 5).

Mycelia: Mycelutveckling och -expansion var uppenbara, vilket inkluderade kompakterade hyfala lagringsnätverk, hypha-hypha-adhesion, anastomos vid båda temperaturerna, med optimala rumsliga arrangemang som bildade kanaler för att ge inflöde av näringsämnen och utflöde av avfallsprodukter och på så sätt stabilisera biofilmen; vid 37 °C var denna kanal tydligare (Figs. 2 (24 timmar), 3 och 4). Dessutom har dessa strukturer observerats av andra forskare . Mikrohyphae: I de tidiga stadierna av biofilmsmognad observerades oregelbundna svampstrukturer, såsom mikrohyphae, i det kliniska isolatet (fig. 4). Detta faktum är relevant eftersom det finns få hänvisningar till mikrohyphaer i litteraturen, och detta är första gången som de beskrivs hos A. fumigatus. Mikrohyphae uppvisar cytoskelettförändringar som genererar korta och smala hyfer med tunna väggar och med böjda ändar. Mikrohyphae är förknippade med en hög enzymatisk aktivitet som gynnar mognadsprocessen och den efterföljande celldispersionen i biofilmstadiet.

Celldispersion

Under celldispersionen lossnar en del av biofilmen, och denna del består av konidier eller hyfer. Asynkron biofilmsutveckling observerades, särskilt i biofilmsmognadsstadiet när de nya konidierna kunde gro, vilket gav upphov till ny myceltillväxt och hyfala modifieringar, t.ex. lockar (fig. 4 och 6). Cellspridning i biofilmen sker som svar på miljöförändringar. Detta verkar för att avlägsna ett farligt ämne från biofilmens huvuddel. Denna process leder till spridning och fortplantning av biofilmcellerna på en ny plats, vilket stöds av komplexa molekylära händelser . Biofilmerna kan ses som skyddande skal för de levande cellerna under dem, med extremt komplexa och oräkneliga funktioner, och därför är de verkligen anmärkningsvärda biologiska konstruktioner. Biofilmer ger skydd mot rovdjur eller kemiska angrepp och ger de inre cellerna ett medium för intracellulär kommunikation, näringsflöde och överföring av genetiskt material. Cellspridningen sprider livskraftiga celler till andra platser i miljön eller inom en värd där cellerna kan föröka sig, vilket underlättar dess fortlevnad. Cellspridning sker som ett resultat av knappa näringsförhållanden i miljön och är således en överlevnadsmekanism. Därför är cellspridning viktig inte bara för att främja den genetiska mångfalden utan också för att undkomma ogynnsamma livsmiljöer, vilket underlättar utvecklingen av nya nischer och mikroorganismens fortlevnad på en ny plats .

.