Antisense oligonukleotider riktade mot SMN2
ASO:er är enkelsträngade nukleinsyror som syntetiseras för att vara komplementära till en RNA-målsekvens. När ASO:n har administrerats tas den upp i cellen via en ännu dåligt definierad endocytisk mekanism och går sedan in i cellkärnan där den binder till målets pre-mRNA.62 Ursprungligen användes ASO:er för att undertrycka genuttryck, antingen genom att blockera översättningen av ett RNA-mål eller genom att främja dess nedbrytning. Numera kan ASO:er också utformas för att förändra ett måls bearbetning eller splicing. SMA-terapeutiska ASO:er är utformade för att ändra den alterativa splicingen av SMN2 pre-mRNA så att exon 7 inkluderas i det slutliga bearbetade transkriptet. Som diskuterats i tidigare kapitel skiljer sig SMN2 från SMN1 genom en övergång från C till T som sker sex nukleotider in i exon 7 (det finns andra skillnader mellan de två sekvenserna, men detta är den viktigaste funktionellt sett). C-to-T-övergången skapar en utökad hämmande kontext i exon 7 (även känd som ”Exinct”).63 Eftersom exon 7 annars är svagt definierad på grund av en svag 5′-splejseställe är C-to-T-mutationen i SMN2 tillräcklig för att tippa över balansen från att inkluderas till att uteslutas.
Splicing regulatory elements spelar en viktig roll när det gäller att bestämma vilka ställen som erkänns av det cellulära splicingmaskineriet. Placeringen och funktionen av relevanta SMN2-element identifierades genom analys av splicingeffekten av en omfattande serie ASO:er som utformats för att komplettera SMN2-sekvensen på ett progressivt iterativt sätt63 .-66 Den introniska splicing silencer ISS-N1 identifierades som ett mycket kraftfullt silencingelement via denna metod; motivet ligger nedströms från 5′-splicingplatsen för exon 7 och binder till splicingrepressorn hnRNP A1.66-68 ASO:er har utformats för att på ett tillförlitligt sätt inducera inkludering av exon 7 genom att rikta in sig på ISS-N1 eller andra reglerande element.
ASO:er kan utformas så att de är bifunktionella. Till exempel har chimära ASO:er som fusionerar SR-rekryteringsdomäner (RS-peptid) med en antisense-sekvens som undertrycker silencer-motiv visat sig öka exon 7-inklusionen och SMN-proteinnivåerna i patientfibroblaster; en enda injektion av den bifunktionella ASO:n kunde inducera SMN-protein i hjärnan hos neonatala möss och resulterade i en förlängd livslängd.65,69 Denna ASO-designstrategi, känd som ESSENCE (exon-specific splicing enhancement by small chimeric effectors), eftersträvades ursprungligen i SMA-terapier, men senare studier visade att RS-peptiden inte var nödvändig för att uppnå en robust effekt på SMN2 exon 7-inklusion. Eftersom ett chimeriskt tillvägagångssätt medför svårigheter vid tillverkningen av ASO:n och begränsar ASO:ns cellpermeabilitet har bifunktionella ASO:er inte testats utförligt på möss och utvecklas för närvarande inte kliniskt.62
När ASO:er med inriktning på ISS-N1 visades vara anmärkningsvärt effektiva när det gäller att främja inklusionen av exon 7 var nästa strategiska fråga att identifiera vilken ASO-ryggrad som skulle användas bäst i en potentiell SMA-behandling. De oligonukleotider som ingår i en ASO modifieras vanligtvis för att optimera de farmaceutiska egenskaperna, t.ex. cellulärt upptag, toxikologi, farmakokinetik och målbindning. En vanlig anpassning, som kom från ett samarbete mellan Ciba-Geigy Ltd. (numera Novartis) och Isis Pharmaceuticals (numera Ionis Pharmaceuticals), är 2′-O-metoxietyl (2′-MOE), som ökar både ASO:s motståndskraft mot nukleasnedbrytning och hybridiseringsaffinitet.70 2′-MOE-oligonukleotider har visat sig vara mycket säkra hos gnagare och primater, inklusive människor.62 Administrering av en 2′-MOE ASO som blockerar ISS-N1 ökade framgångsrikt SMN2 exon 7 på ett dos- och tidsberoende sätt hos SMA-möss, vilket förbättrade den neuromuskulära patologin och ökade överlevnaden dramatiskt.68,71,72 Ionis Pharmaceuticals utvecklar i samarbete med Biogen en 2′-MOE ASO-behandling som kallas nusinersen (även känd som IONIS-SMNRx och tidigare kallad ISIS-SMNRx). Prekliniska studier av nusinersen på icke-mänskliga primater visade att en enda intratekal injektion kunde resultera i de vävnadskoncentrationer som krävs för betydande förbättringar av exon 7-inklusionen och att dessa koncentrationer bibehölls i flera månader62 . Läkemedlets långa halveringstid innebär att patienterna kanske bara behöver en intratekal injektion med några månaders mellanrum.73 I en öppen fas 1-studie på SMA typ II/III-patienter i åldrarna 2-14 år tolererades en enda injektion av nusinersen väl och tycks ha korrelerat med ökade HFMSE-poäng vid den högsta dosen.74 I juni 2015 släppte Ionis nya data från en pågående öppen fas 2-studie med nusinersen på spädbarn av typ I, som visade att spädbarnen levde längre och uppnådde fler motoriska milstolpar än vad som normalt skulle kunna förväntas utifrån sjukdomens naturliga historia.75 Dessutom stöddes läkemedlets verkningsmekanism av data som visade en ökning av mängden fullängds SMN2 mRNA och SMN-protein i hjärn- och ryggmärgsvävnader från obduktioner av patienter som fått behandling. Ionis offentliggjorde också data från sin öppna förlängningsstudie i fas 2 på barn med typ II/III SMA som visade att 57 % av försökspersonerna uppnådde en förbättring med minst tre punkter på HFMSE och en genomsnittlig förbättring på 55 m på 6-Minute Walk Test (6MWT).76 Fas 3-studier av nusinersen genomförs för närvarande både på spädbarn och vuxna med SMA (NCT02193074; NCT02292537); resultaten bör finnas tillgängliga under 2017.
Och även om inga säkerhetsproblem ännu har observerats vid användning av 2′-MOE vid behandling av SMA har vissa toxiciteter förknippats med 2′-MOE ASO:er i andra patientpopulationer.77,78 En annan modifiering av ryggraden som undersöks för användning i SMA och som kan kringgå dessa problem är fosforamidatmorfolinooligomerer (PMO). PMO:er har visat sig vara effektivare än 2′-MOE i musmodeller av Duchennes muskeldystrofi (DMD), en annan neuromuskulär sjukdom hos barn, och tolererades också väl av DMD-patienter.79 En ICV-injektion av morfolino-OSO:er som kompletterade ISS-N1 förbättrade signifikant överlevnaden hos SMA-möss utan tecken på toxicitet i det centrala nervsystemet (CNS).80,81 Ett morfolino som är riktat mot ISS-E1, en intronisk splicing silencer som finns uppströms exon 7, förbättrar också fenotypen hos SMA-möss.82 Detta tillvägagångssätt har ännu inte tagits med i kliniken.
Som grundämne kan ASO:s kemi påverka lämpligheten för olika leveransmetoder, behovet av upprepad dosering och ge tillhörande toxicitet – allt detta har viktiga implikationer för dess terapeutiska användning. Dessutom måste en ASO som används för att behandla SMA förbli farmakologiskt aktiv i vävnader i CNS, särskilt motoriska neuroner. Oavsett ryggrad kommer varje ASO som utformas för behandling av SMA sannolikt att behöva administreras direkt till cerebrospinalvätskan via intratekal injektion. Även om vissa studier med perifer ASO-administrering i neonatala möss visade effekt, är blod-hjärnbarriären inte helt bildad hos unga möss och en perifert administrerad ASO kan tränga in i CNS i en grad som inte är möjlig hos människor.71 Uppmuntrande nog har ASO:er som injicerats intratekalt visat sig ha en stor spridning bland viktiga vävnader i CNS, t.ex. motoriska neuroner, astrocyter och mikroglior.72,83-85
Och även om intratekal injektion är något invasiv och kräver sedering eller anestesi har ASO:er flera betydande fördelar jämfört med andra experimentella modaliteter, inklusive hög målspecificitet, anmärkningsvärd effektivitet, liten toxicitet jämfört med systemisk tillförsel av ASO:er och relativt enkla tillverkningsprocesser jämfört med biologiska läkemedel (men inte små molekyler). Mer information finns i kapitel 18.