Bookshelf

Specimen Requirements and Procedure

ELISA utförs i polystyrenplattor, vanligen i 96-borrhålsplattor som är belagda för att binda proteinet mycket starkt. Beroende på ELISA-typen krävs för testning en primär och/eller sekundär detektionsantikropp, analyt/antigen, beläggningsantikropp/antigen, buffert, tvätt och substrat/kromogen. Den primära detektionsantikroppen är en specifik antikropp som endast binder till det aktuella proteinet, medan en sekundär detektionsantikropp är en andra enzymkonjugerad antikropp som binder till en primär antikropp som inte är enzymkonjugerad.

Det finns fyra huvudsakliga allmänna steg för att slutföra en ELISA-immunoassay. Dessa steg är följande:

1. Beläggning (med antingen antigen eller antikropp)

2. Blockering (vanligen med tillsats av bovint serumalbumin )

3. Detektion

4. Slutlig avläsning

   Detektion sker genom tillsats av ett substrat som kan generera en färg. Det finns många substrat tillgängliga för användning vid ELISA-detektion. De mest använda är dock pepparrotsperoxidas (HRP) och alkaliskt fosfatas (ALP). Substratet för HRP är väteperoxid och resulterar i en blå färgförändring. ALP mäter den gula färgen av nitrofenol efter inkubationsperioder i rumstemperatur på 15-30 minuter och använder vanligen P-nitrofenylfosfat (pNPP) som substrat.

   Mellan vart och ett av de fyra stegen ovan sker en ”tvättning” av plattan med hjälp av en buffert, t.ex. fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och ett icke-joniskt detergent, för att avlägsna obundet material. Brunnarna tvättas två eller flera gånger under varje tvättsteg, beroende på vilket specifikt protokoll som följs.

   I ELISA-protokollet placeras vanligtvis en serieutspädning av koncentrationer i plattans brunnar. Efter att resultaten har mätts ritas en standardkurva från data från serieutspädningarna med en koncentration på x-axeln med hjälp av en logaritmisk skala och absorbans på y-axeln med hjälp av en linjär skala.

   Det finns fyra huvudtyper av ELISA:

   • Direkt ELISA (antigenbelagd platta; screening av antikropp)

   • Indirekt ELISA (antigenbelagd platta; screening av antigen/antikropp)

   • Sandwich ELISA (antikroppsbelagd platta; screening av antigen)

   • Kompetitiv ELISA (screening av antikropp)

     Direkt ELISA

     Både direkta och indirekta ELISA:er inleds med beläggning av antigen på ELISA-plattorna. Det första bindningssteget innebär att antigenet tillsätts till plattorna, som inkuberas i en timme vid 37 grader C eller kan inkuberas vid 4 grader C över natten. När inkuberingen är avslutad är nästa steg att tvätta plattorna från eventuella obundna antikroppar och blockera eventuella obundna platser på ELISA-plattan med hjälp av medel som BSA, ovalbumin, aprotinin eller andra animaliska proteiner. Detta andra steg är viktigt eftersom det förhindrar att ospecifika antikroppar binds till plattan och minimerar falskt positiva resultat. Efter tillsats av bufferten tvättas plattan på nytt och en utvald enzymkonjugerad primär detektionsantikropp tillsätts. Plattan inkuberas ytterligare i en timme.

     I en direkt ELISA binder den primära detektionsantikroppen direkt till det aktuella proteinet. Därefter tvättas plattan på nytt för att avlägsna eventuella obundna antikroppar och därefter tillsätts ett substrat/kromofor, t.ex. alkaliskt fosfatas (AP) eller pepparrotsperoxidas (HRP) till plattan, vilket resulterar i en färgförändring. Provets färgförändring sker antingen genom att AP hydrolyserar fosfatgrupper från substratet eller genom att HRP oxiderar substratet. Fördelarna med att använda direkt ELISA är bland annat att man eliminerar korsreaktivitet med sekundära antikroppar, och på grund av färre steg går det snabbt jämfört med indirekt ELISA. Dess nackdelar är den låga känsligheten jämfört med andra typer av ELISA och den höga reaktionskostnaden.

     Indirekt ELISA

     Stråken i den indirekta ELISA är identiska med den direkta ELISA, med undantag för ett extra tvättsteg och de typer av antikroppar som tillsätts efter det att bufferten avlägsnats. Indirekt ELISA kräver två antikroppar, en primär detektionsantikropp som fastnar på det aktuella proteinet och en sekundär enzymkopplad antikropp som är komplementär till den primära antikroppen. Den primära antikroppen tillsätts först, följt av ett tvättsteg, varefter den enzymkonjugerade sekundära antikroppen tillsätts och inkuberas. Därefter är stegen desamma som i den direkta ELISA, vilket inkluderar ett tvättsteg, tillsats av substrat och detektion av en färgförändring.

     Den indirekta ELISA har en högre känslighet jämfört med den direkta ELISA. Den är också billigare och mer flexibel på grund av de många möjliga primära antikroppar som kan användas. Den enda stora nackdelen med denna typ av ELISA är risken för korsreaktivitet mellan de sekundära detektionsantikropparna.

     Sandwich ELISA

     Till skillnad från direkta och indirekta ELISA börjar sandwich ELISA med en fångstantikropp belagd på plattans brunnar. Den kallas ”sandwich” eftersom antigenerna ligger mellan två lager antikroppar (fångst- och detektionsantikroppar). Efter att ha tillsatt fångstantikroppen på plattorna täcks plattorna och inkuberas över natten vid 4 °C. När beläggningssteget är klart tvättas plattorna med PBS och buffras/blockeras sedan med BSA. Bufferttvättarna utförs i minst 1-2 timmar i rumstemperatur. Slutligen tvättas plattan med PBS en gång till innan antigenet tillsätts.

     Det aktuella antigenet tillsätts sedan till plattorna för att binda till fångstantikroppen och inkuberas i 90 minuter vid 37 grader C. Plattan tvättas på nytt och den primära detektionsantikroppen tillsätts sedan till plattan och inkuberas i ytterligare 1-2 timmar vid rumstemperatur, följt av en buffertvätt. Därefter tillsätts den sekundära enzymkonjugerade antikroppen och inkuberas i ytterligare 1 till 2 timmar. Plattan tvättas på nytt och substratet tillsätts för att åstadkomma en färgförändring. Sandwich-ELISA har den högsta känsligheten av alla ELISA-typer. De största nackdelarna med denna typ av ELISA är tiden och kostnaden samt den nödvändiga användningen av ”matched pair” (divalent/multivalent antigen) och sekundära antikroppar.

     Kompetitiv ELISA

     Den kompetitiva ELISA-testet testar förekomsten av en antikropp som är specifik för antigener i testserumet. Denna typ av ELISA använder två specifika antikroppar, en enzymkonjugerad antikropp och en annan antikropp som finns i testserumet (om serumet är positivt). Genom att kombinera de två antikropparna i brunnarna kan en konkurrens om bindning till antigenet uppstå. Förekomsten av en färgförändring innebär att testet är negativt eftersom den enzymkonjugerade antikroppen har bundit antigenerna (inte antikropparna i testserumet). Avsaknad av färg visar att testet är positivt och att det finns antikroppar i testserumet. Den kompetitiva ELISA-testet har en låg specificitet och kan inte användas i utspädda prover. Fördelarna är dock att det behövs mindre provrening, att den kan mäta ett stort antal antigener i ett givet prov, att den kan användas för små antigener och att den har låg variabilitet.