Bulk RNA-seq Data Standards and Processing Pipeline

Översikt över pipeline

Pipeline för Bulk RNA-seq utvecklades som en del av ENCODE:s serie Uniform Processing Pipelines. Den fullständiga pipelinekoden är fritt tillgänglig på Github och kan köras på DNAnexus (länken kräver att ett konto skapas) till deras nuvarande pris.

EnCODE Bulk RNA-seq pipeline kan användas för både replikerade och icke replikerade, parvisa eller enkelriktade och strängspecifika eller icke strängspecifika RNA-seq-bibliotek. Biblioteken måste genereras från mRNA (poly(A)+, rRNA-depleted total RNA eller poly(A)-populationer som är storleksselekterade så att de är längre än cirka 200 bp. I framtiden kan denna pipeline också användas för att bearbeta PAS-seq- och Bru-seq-data.

Schematisk pipeline för data med parade ändar

Se den aktuella instansen av denna pipeline för data med parade ändar

Skematisk pipeline för data med enkla ändar

Se de aktuella instanserna av denna pipeline för data med enkla ändar

Inputs:

Filformat	Information i filen	Fil Beskrivning	Anteckningar
fastq	läser	G-Zippade RNA-seq-avläsningar i bulk	Avläsningarna måste uppfylla de kriterier som anges i Uniform Processing Pipeline Restrictions.
tar	genomindex	Genererat av STAR eller TopHat	Se stycket med rubriken ”Regarding alignment and quantification” (Angående anpassning och kvantifiering) under tabellen ”Outputs” (utdata) för mer information om aligners och deras index.
fasta	spike-in-sekvens	ERCC Spike-ins (External RNA Control Consortium)	Spike-ins är i praktiken kontroller för RNA-seq-experimentet.

Outputs:

Filformat	Information i filen	Filbeskrivning	Anteckningar
bam	utjämning	Producerad genom att mappa läsningar till genomet.	Se stycket med rubriken ”Angående anpassning och kvantifiering” under tabellen ”Resultat” för mer information om anpassarna och deras index.
bam	transkriptomanpassningar	Framställs genom att mappa avläsningar till transkriptomet.
bigWig	signal	Normaliserad RNA-seq-signal	För strängdata genereras signaler för unika läsningar och unika+multimappningsläsningar i både plus- och minussträngen. För osträngade data genereras signaler för unika läsningar och unika+multimapping läsningar utan hänsyn till strängidentitet.
tsv	genkvantifieringar	Inkluderar spike-ins-kvantifieringar	Specifikationerna för filformatet är följande: kolumn 1: gene_id kolumn 2: transcript_id(s) kolumn 3: length column 4: effective_length column 5: expected_count column 6: TPM (transcripts per million) column 7: FPKM (fragments per kilobase of transcript per million) column 8: posterior_mean_count column 9: Posterior_standard_deviation_of_count kolumn 10: pme_TPM kolumn 11: pme_FPKM kolumn 12: TPM_ci_lower_bound kolumn 13: TPM_ci_upper_bound kolumn 14: FPKM_ci_lower_bound kolumn 15: FPKM_ci_upper_bound
tsv	transkriptkvantifieringar	Inkluderar spike-ins-kvantifieringar	Vänligen se försiktighet angående transkriptkvantifieringar i stycket nedan med titeln ”Regarding alignment and quantification”.
Pipeline producerar också kvalitetsmått, inklusive Spearmankorrelation och läsdjup.

Regering av anpassning och kvantifiering:

Kartläggningen av läsningarna görs med hjälp av STAR-programmet (i vissa fall används både STAR- och TopHat-anpassare för att producera separata bam-filer) och kvantifieringen av gener och transkriptioner görs med RSEM-programmet. Även om det finns en allmän överensstämmelse mellan de kartläggningar och genkvantifieringar som produceras av olika RNA-seq-pipelines, kan kvantifieringarna av enskilda transkriptisoformer, som är mycket mer komplexa, skilja sig avsevärt beroende på vilken bearbetnings pipeline som används och har en okänd noggrannhet. Därför kan anpassningar och genkvantifieringar användas med säkerhet, medan transkriptkvantifieringar bör användas med försiktighet.

Genomreferenser

Se de genomreferenser och kromosomstorlekar som används i denna pipeline

Dessa pipelines kräver både information om sammansättning för den aktuella arten och en genreferens. Var och en av huvudprogrammen TopHat, STAR och RSEM skapar ett index som används i efterföljande steg. Mer information om användningen av RSEM finns här.

Exogen RNA spike-in-kontroller

Exogen RNA spike-in-kontroller läggs till prover för att skapa en standardbaslinje för kvantifiering av RNA-uttryck (PMC3166838). ENCODE-konsortiet standardiserar användningen av Ambion Mix 1 kommersiellt tillgängliga spike-ins i en utspädning på ~2 % av de slutliga kartlagda läsningarna. Det finns dock en blandning av äldre data och importerade data. För att spåra de spike-ins som används i ett visst bibliotek finns det därför ett dataset som är kopplat till biblioteket. Datasetetet kommer att innehålla sekvensfilen för spike-ins i fasta-format och information om koncentrationerna. Dessa spike-in-sekvenser förväntas återfinnas i det genomindex som används i kartläggningssteget eller -stegen och i den därefter genererade bam-filen. Kvantifieringarna av sekvenserna finns i RSEM:s transkript- och genkvantifieringsfiler.

Se spike-ins-dataset
Se analyscertifikatet för ERCC spike-ins
Access the ERCC dash board

Länkar och publikationer

Sök efter data som genererats av den här pipelinen: Alla | endast parade ändar | endast enändiga ändar
Utforska publikationer (pågående)