Resultat och diskussion
Den autofagiska flödesanalysen som beskrivs i Jiang et al. är en kvantitativ rapportöranalys för grönt fluorescerande protein (GFP) som mäter de ratiometriska förändringarna av polyQ-GFP till fritt GFP via Western blot-analys. En multicistronisk reporterkonstrukt utformades för att koda för två proteiner; polyQ kopplat till N-terminalt GFP och fritt GFP. Virussekvensen 2A (v2A) placerades som en länkregion mellan de sekvenser som kodar för de två proteinerna för att möjliggöra stökiometrisk översättning av två separata proteiner från en öppen läsram (fig. 1a) .
Generering av de förmodade Q52-, Q31- och Q10-GFP-konstruktionerna med hjälp av Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP multicistronisk reporterkonstruktion. a Vektorkarta för Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. b Sammanfattning av användningen av degenererade CAA- och CAG-kodoner i denna konstruktion. c Kromatograf av konstruktionen som visar de slumpmässigt interagerande glutaminkodande CAG- och CAA-tripletterna. d Schematisk illustration av PCR-baserad uteslutningsamplifiering av den Q80-GFP-innehållande konstruktionen för att generera polyQ-konstruktioner med ett lägre antal glutaminrepetitioner. e Q80-sekvensen visar Q52-, Q31- och Q10-primers bindningsställen. f Sekvenser av primers avsedda att generera Q52-, Q31- och Q10-konstruktioner. g Analytisk agarosgelelektrofores för var och en av de förmodade Q80-, Q52-, Q31- och Q10-vektorerna med hjälp av primers som flankerar polyQ-regionen. PCR-produktstorlekar på ~ 270, ~ 180, ~ 120 och ~ 60 bp för de avsedda putativa Q80-, Q52-, Q31- respektive Q10-GFP-konstruktionerna sågs
Vi utformade en polyQ-sekvens som innehåller 80 glutaminrepetitioner (Q80). Sekvensen utformades för att ha låg upprepningslikhet genom att slumpmässigt varva glutaminkodande CAG-tripletter med glutaminkodande CAA-tripletter (fig. 1b, c). Nukleotidbytena gjordes med ögat för att generera ett halvt slumpmässigt mönster. Denna icke-repetitiva sekvensdesign borde inte bara öka sekvensstabiliteten under förökning i bakterier, utan möjliggjorde också designen av PCR-primers som annealade till specifika regioner i sekvensen.
Den Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktion som beskrivs ovan syntetiserades kommersiellt (Biomatik Corporation) (se tilläggsfil 1) och subklonades via BamHI- och ClaI-restriktionsplatserna i den Tol2-transposonbaserade genöverföringsvektorn pT2AL200R150G (nedan kallad Tol2), som finns tillgänglig från Kawakami-laboratoriet (Fig. 1a och se Additional file 2).
PolyQ-konstruktioner med lägre antal glutaminrepetitioner genererades genom PCR-baserad uteslutningsamplifiering av Tol2-Q80-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. Primerna var utformade för att amplifiera runt vektorn med uteslutande av ett definierat antal glutaminrepetitioner för att generera de aktuella konstruktionerna (fig. 1d-f). Vi strävade efter att generera vektorer med ungefär 52 (Q52), 31 (Q31) och 10 (Q10) glutaminrepetitioner. De förmodade Q52- och Q31-vektorerna genererades med hjälp av samma omvända primer kopplad till olika framåtprimer. Denna gemensamma omvända primer amplifierade 2 glutaminrepetitioner, medan de framåtriktade primrarna amplifierade de ytterligare 50 och 29 glutaminrepetitioner som behövdes för att generera Q52- respektive Q31-vektorerna. Den omvända primerns position försköts något för att optimera amplifieringen av den förmodade Q10-vektorn, så att den omvända primern nu amplifierade 5 glutaminrepetitioner medan den framåtriktade primern amplifierade de återstående 5 glutaminrepetitioner (fig. 1d-f). Genom att använda stränga glödgningstemperaturer i PCR-reaktionen fick vi en specifik primerbindning. Gelextraherade och renade PCR-produkter fosforylerades, cirkulariserades genom självligering och transformerades därefter till kompetenta celler (se tilläggsfil 3). PCR med primers som flankerade polyQ-regionen visade ungefär förväntade produktstorlekar för de tänkta putativa Q52-, Q31- och Q10-vektorerna (fig. 1g). De genererade konstruktionerna sekvenserades för att avgöra om de förväntade polyQ-repeterna var närvarande. Medan Q52-konstruktionen hade det förväntade antalet glutaminrepetitioner (fig. 2a, b), visade sekvenseringen mindre avvikelser från de förväntade polyQ-numren för de andra två konstruktionerna, där vektorn Tol2-Q31-GFP-v2A-GFP hade 21 glutaminrepetitioner (hädanefter kallad Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP) (fig. 2c, d) och Tol2-Q10-GFP-v2A-GFP-vektorn hade 11 glutaminrepetitioner (nedan kallad Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP) (fig. 2e, f). Ytterligare analyser visade att den genererade Q21-sekvensen härstammade direkt från den ursprungliga sekvensen och att förlusten av glutaminrepetitioner berodde på att den framåtriktade Q31-primören band 30 bp nedströms från den förutspådda bindningsstället. Däremot genererades den ytterligare glutaminrepetitionen i Q11-sekvensen de novo, ett tillägg av ett CAA-kodon.
Vektorkarta och sekvensanalys av de konstruktioner som kodar för Q52, Q21 och Q11-GFP som genererats genom PCR-baserad excisionsamplifiering. a Vektorkarta för Tol2-Q52-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. b Kromatograf av Q52-konstruktionen. c Vektorkarta för Tol2-Q21-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. d Chromatograf av Q21-konstruktionen. e Vektorkarta för Tol2-Q11-GFP-v2A-GFP-konstruktionen. f Kromatograf av Q11-konstruktionen
För att studera polyQ-proteinets aggregeringskinetik och ”autofagiska flöde” in vivo injicerade vi de genererade polyQ-vektorerna (25 ng/μL) och transposas-mRNA (25 ng/μL) i grupper av zebrafiskembryon i ett cellstadium (fig. 3a, b). Western blot-analys med anti-GFP-antikropp av 24 h efter befruktning (hpf) embryolysat (10 embryon per prov) utfördes för varje grupp. Den tomma Tol2-vektorn (25 ng/μL) och transposas mRNA (25 ng/μL) injicerade och icke injicerade embryon ingick som kontroller. Embryon som injicerats med polyQ-konstruktionerna producerade som förväntat två band som detekterades av anti-GFP-antikroppen; GFP fäst vid polyQ (polyQ80-GFP vid ~ 48 kDa, polyQ52-GFP vid ~ 38 kDa, polyQ21-GFP vid ~ 33 kDa och polyQ11-GFP vid ~ 31 kDa) och fri GFP (~ 27 kDa) (fig. 3c). Var och en av de polyQ-GFP-konstruktuttryckande embryolysaten visade också ett svagare band av högre proteinstorlek som motsvarar den fullständiga polyQX-GFP-v2A-GFP-konstruktionen (polyQ80-GFP-v2A-GFP vid ~ 75 kDa, polyQ52-GFP-v2A-GFP vid ~ 65 kDa, polyQ21-GFP-v2A-GFP vid ~ 60 kDa och polyQ11-GFP-v2A-GFP vid ~ 58 kDa). Detta band representerar de ~ 10 % av det totala proteinet som översätts som ett enda protein i full längd vid användning av v2A-sekvenssystemet . Förhållandet Q80-GFP:GFP, Q52-GFP:GFP, Q21-GFP:GFP och Q11-GFP:GFP är ~ 5, ~ 4, ~ 2 respektive ~ 1 (fig. 3d). Eftersom v2A-sekvensen möjliggör en stökiometrisk översättning av polyQ-GFP- och GFP-proteinerna bör i teorin förhållandet polyQ-GFP:GFP vara 1. De större förhållandena som observerats kan tyda på en ackumulering av dessa proteiner. Dessa observationer stämmer överens med litteraturen, där det har visats att polyQ-GFP-fusionskonstruktioner som innehåller mer än 19 glutaminrester aggregeras i transfekterade celler på ett längdberoende sätt . Dessa observationer leder oss till slutsatsen att våra Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktioner utgör ett användbart verktyg för att studera ”autofagiskt flöde” in vivo i en larvig zebrafiskmodell.
Analys av Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktionens uttryck i D. rerio. Zebrafiskembryon injicerades med 25 ng/µL av Tol2-QX-GFP-v2A-GFP-konstruktionen och 25 ng/µL mRNA som kodar för Tol2-transposas. a Ljusfältsbilder (övre paneler) och fluorescerande bilder (nedre paneler) av den vänstra sidovyn av zebrafiskembryons huvud- och bålregioner som uttrycker Q80, Q52, Q21 och Q11-GFP, ~ 24 hpf. b Ljusfält (övre paneler) och fluorescerande bilder (nedre paneler) av den vänstra sidovyn av zebrafiskembryon som uttrycker Q80, Q52, Q21 och Q11-GFP, ~ 24 hpf. c Western blot-analys av uttrycket av Qx-GFP-konstruktioner i D. rerio. Proteiner isolerades från ~ 24 hpf embryon som uttrycker Q80-, Q52-, Q21- och Q11-GFP-konstruktionerna. Proteinerna löstes upp på en 10 % SDS-PAGE-gel och överfördes till ett nitrocellulosamembran. Membranet provades med en anti-GFP-antikropp. Den ”tomma” Tol2-vektorn har en uttryckt GFP-gen som ersätts vid insättning av konstruktionen. d Western blot-kvantifiering. GFP-intensiteten för varje numrerat band i Western blot och förhållandet mellan Qx-GFP och fri GFP presenteras
Slutsats
Slutsatsen i den här studien är att den erbjuder en robust och lättanvänt lösning för att generera polyQ-repetitioner som ligger nära de avsedda längderna. För att generera exakt antal glutaminrepetitioner kan efterföljande amplifieringsomgångar med ändrade primersekvenser genomföras. Dessutom kan primerlängden ökas för att öka specificiteten hos primerns annealing till mallen. Vår teknik har flera fördelar jämfört med befintliga metoder för PCR-baserad amplifiering av repetitiva regioner och syftar till att minimera genereringen av ospecifika PCR-produkter och felaktiga repetitioner genom att utnyttja den genetiska kodens kodredundans för att generera en synonym DNA-kodningssekvens med minskad repetition. Dessutom är vårt tillvägagångssätt inte begränsat till att generera polyQ-repetitionssekvenser utan kan också generaliseras för att generera andra nukleotidrepetitionssekvenser. Dessutom är vår metod relativt billig, eftersom endast den inledande polyQ80-GFP-v2A-GFP-konstruktionen kräver kommersiell syntes, vars kostnad beror på priset per nukleotidbas, längd, renhet och massa. Alla andra material som krävs är standardreagenser som används för molekylär kloning. Sammanfattningsvis ger den beskrivna tekniken en lättanvänt och prisvärd lösning för att generera upprepade kodande DNA-sekvenser som kan manipuleras efter behov.