Överraskande upptäckt av en ny väg som styrs av Notch-signalproteinet öppnar dörren för bättre läkemedelsutveckling
By Lindsay Brownell
(BOSTON) – Varje minut pulserar en och en halv liter blod genom kroppens nätverk av vener och artärer. Kraften i detta blodflöde hjälper till att hålla cellerna som kantar blodkärlen, så kallade endotelceller, friska. När blodflödet störs, t.ex. vid kirurgiska ingrepp eller en stroke, börjar kärlen läcka, vilket kan orsaka en mängd inflammatoriska reaktioner som leder till cellskador och sjukdomar. Forskare vid Wyss-institutet vid Harvard-universitetet försökte lösa mysteriet om hur blodflödet håller kärlen intakta och upptäckte till sin förvåning en helt ny cellsignalväg som är en lovande måltavla för läkemedel för att behandla en rad olika försvagande tillstånd.
”Vi fann att det välkända Notch-proteinet är ansvarigt för att hålla blodkärl från att bli läckande, och att det gör det genom en sekundär signalväg som fungerar på ett helt annat sätt än den kända transkriptionsbaserade vägen”, säger Chris Chen, M.D., Ph.D., associerad fakultetsmedlem vid Wyss-institutet, grundande direktör för Biological Design Center och framstående professor i biomedicinsk teknik vid Boston University, som är motsvarande författare till artikeln. ”Den här nya vägen är inte bara spännande ur ett upptäcktsperspektiv, utan skulle också kunna förbättra några av biverkningarna av cancer- och kardiovaskulära läkemedel för att göra dem säkrare och effektivare.” Studien publiceras idag i Nature.
Endotelcellerna som kantar blodkärlen är tätt sammanlänkade genom förbindelser som kallas adherens junctions för att bilda en barriär som håller blodet inne i kärlet och reglerar hur lätt andra ämnen kan passera in och ut ur det. För att studera denna barriär och avgöra varför bristande blodflöde får den att läcka byggde forskarna en blodkärl-on-a-chip-modell som består av en kanal som är fodrad med ett lager av mänskliga endotelceller omgiven av extracellulärt matris i en mikrofluidisk anordning, vilket gjorde det möjligt för dem att enkelt simulera och styra blodflödet genom ett kärl och utvärdera cellernas reaktioner.
Endotelceller som upplevde blodflöde uppvisade en ökad aktivitet av det transmembranära proteinet Notch1, medan celler som utsattes för statiskt blod inte gjorde det. När forskarna tillsatte en kemikalie som blockerar Notch1-aktivering genom att förhindra att dess intracellulära domän lossnar, observerade de att kärlet började läcka, vilket de fastställde orsakades av att adherens-junkterna mellan angränsande endotelceller bryts och att aktinfibrerna omorganiseras inom varje cell. Detta bekräftade att aktivering av Notch1 genom blodflöde är nödvändig för att blodkärlens endotelbarriär ska bildas och upprätthållas.
Märkligt nog ledde inte förhindrandet av Notch1:s intracellulära domän från att initiera transkription efter att den lossnat (vilket är Notch1:s väletablerade verkningsmekanism) till att kärlen blev läckande, vilket innebar att någon annan del av proteinet, vars funktion inte involverade transkription, reagerade på blodflödet. Denna misstanke stärktes av in vivo-experiment där forskarna injicerade möss med en kemikalie som blockerade Notch1 tillsammans med blått färgämne, och såg att färgämnet läckte ut ur blodkärlen hos de behandlade mössen i en mycket snabbare takt än förväntat. ”Att transkribera en gen till ett protein som sedan utför någon funktion i cellen tar i allmänhet ungefär två timmar, men vi såg läckage inom 30 minuter, vilket ytterligare tyder på att den process som styr barriärens genomsläpplighet fungerar via en helt annan mekanism”, säger Bill Polacheck, doktorand, Postdoctoral Fellow vid Wyss-institutet och medförfattare till artikeln.
När de fastställde att den intracellulära domänen inte var inblandad i regleringen av endotelbarriären, sökte forskarna efter aktivitet i andra delar av Notch1. De använde CRISPR/Cas-9 för att radera olika delar av Notch1-genen och fann att radering av den del som kodar för den intracellulära domänen inte hade någon effekt på permeabiliteten, medan radering av den lilla delen av transmembrandomänen (TMD) också ledde till att kärlläckaget ökade under flödesförhållanden. ”Detta är första gången den biologiska funktionen hos Notch TMD har utvärderats”, säger Matthew Kutys, Ph.D., gästforskare vid Wyss-institutet och medförfattare. ”Den antogs i stort sett vara inaktiv och bara försvinna efter aktivering, och i de flesta läroböcker och forskningsartiklar visas den inte ens som en distinkt del av Notch-receptorerna.” Genom ytterligare tester kom de fram till att när Notch1 aktiveras och dess intracellulära domän frigörs, sätter dess TMD ihop ett komplex i membranet med proteinerna VE-cadherin, Rac1, LAR och Trio, som tillsammans sätter ihop och upprätthåller adherens-junkterna mellan cellerna och distribuerar aktinfibrer mot cellmembranet för att stödja dessa junkter.
”Så här i efterhand kastade vi tärningar med detta projekt, för genom att välja att undersöka Notch gav vi oss in på ett av de mest överfulla forskningsområdena inom biologin. Men vårt teknikbaserade tillvägagångssätt lät oss studera det på ett nytt sätt, utan inflytande eller fördomar från tidigare arbete, vilket jag tror är det som gjorde oss tillräckligt öppna för att observera och karakterisera denna nya, oväntade väg”, säger Polacheck. ”Vetskapen om att Notch1 reglerar celladhesion utöver celldifferentiering ger också ett nytt ramverk för att förstå samordningen av komplexa cellprocesser, i och med att enskilda molekyler som Notch kan spela flera roller”, tillägger Kutys.
Upptäckten av att Notch1 tjänar olika funktioner, och vetskapen om vilka delar av proteinet som styr varje funktion, gör det möjligt att utveckla nya läkemedel som är både mer effektiva och mindre giftiga. ”Notch är ett mål för vissa cancerbehandlingar, men dessa läkemedel är kända för att orsaka ödem och andra problem. Nu arbetar vi aktivt med att separera Notchs två vägar så att vi kan skapa läkemedel som enbart riktar sig mot den intracellulära domänen, vilket skonar TMD och därmed bevarar blodkärlens integritet”, säger Karen Hirschi, Ph.D., professor i medicin och genetik vid Yale School of Medicine, som medverkade i studien. Kunskapen om att Notch styr kärlens genomsläpplighet gör det till en kandidat för nya läkemedel för behandling av hjärt- och kärlsjukdomar också, och teamet undersöker också TMD som ett potentiellt terapeutiskt medel i sig. Cellmodeller som utsattes för läckageframkallande inflammation uppvisade en dramatisk minskning av läckage när de konstruerades för att uttrycka TMD.
”De samarbeten som Wyss-institutet möjliggör och främjar mellan olika områden, som maskinteknik och molekylärbiologi, främjar nya tillvägagångssätt för att lösa gamla problem som kan leda till verkligt paradigmskiftande resultat”, säger Donald Ingber, läkare och doktor, grundande direktör för Wyss-institutet och Judah Folkman-professor i kärlbiologi vid Harvard Medical School och kärlbiologiprogrammet vid Boston Children’s Hospital, som också är professor i bioteknik vid Harvard Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS). ”Den här studien är ett utmärkt exempel på de fördelar som den här typen av partnerskap kan ge vetenskapen och samhället.”
Att ytterligare författare till studien är Jinling Yang, Ph.D., Postdoctoral Fellow vid Wyss-institutet; Jeroen Eyckmans, Ph.D., tidigare Wyss Postdoctral Fellow och nuvarande gruppledare vid Boston University; Yinyu Wu, doktorand vid Genetiska institutionen vid Yale; och Hema Vasavada, laboratorieansvarig vid Yale School of Medicine.
Denna forskning stöddes av bidrag från National Institutes of Health (NIH), National Science Foundation (NSF), ett Ruth L. Kirchstein National Research Service Award, The Hartwell Foundation och Wyss Institute vid Harvard University.
- PUBLIKATION – Nature: Ett icke-kanoniskt Notch-komplex reglerar adherens junctions och vaskulär barriärfunktion