Extrinsic kontra intrinsic apoptosvägar vid kemoterapi mot cancer

Skematisk bild av domänstrukturen hos mänskliga IAP-proteiner. BIR, Baculovirus IAP-repeats; CARD, caspase-activating and recruitment domain; RING, ring zinc-finger.

Den fysiologiska mitokondriella funktionen hos Smac/DIABLO är okänd och DIABLO -/- möss verkar normala (Okada et al., 2002). Även om in vitro-klyvningen av procaspas-3 vid tillsats av cytokrom c hämmades i lysat av Smac -/- celler svarade Smac -/- möss och celler normalt på apoptotiska stimuli såsom UV-strålning, staurosporin, etoposid och TNF/cyklohexamid (Okada et al., 2002). Dessa observationer tyder på att det finns redundanta faktorer som kompenserar för förlusten av Smac/DIABLO, möjligen HtrA2/OMI.

Omi/HtrA2 är ett kärnkodat, 49 kDa-protein med en N-terminal mitokondriell lokaliseringssignal som medierar dess translokation till det mitokondriella intermembranutrymmet (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). Omi/HtrA2 bearbetas i intermembranutrymmet till den 37 kDa mogna formen och frigör en IBM vid sin N-terminus (Suzuki et al., 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002) (tabell 1). Även om rekombinant Omi/HtrA2 kan katalysera sin egen mognad in vitro, är det proteas som ansvarar för dess mognad i celler fortfarande okänt (Martins et al., 2002). Omi/HtrA2 spelar en viktig roll i regleringen av mitokondriell homeostas som kräver dess proteolytiska aktivitet, även om de molekylära målen och interaktionspartnerna för Omi/HtrA2 i mitokondrien ännu inte har definierats (Saelens et al., 2004). När Omi/HtrA2 väl frigörs från mitokondrier till cytosolen främjar den celldöd på ett caspasberoende sätt genom att antagonisera IAPs och på ett caspasoberoende sätt som proteas (Saelens et al., 2004). I likhet med Smac/DIABLO blockerar Omi/HtrA2 IAPs genom sitt N-terminala IAP-bindande motiv som presenteras i en trimerisk konfiguration (Li et al, 2002)

Och även om frisättningen av cytokrom c till cytosolen direkt utlöser aktivering av caspas-3 genom bildandet av det cytokrom c/Apaf-1/caspase-9-innehållande apoptosomkomplexet, främjar Smac/DIABLO och Omi/HtrA2 indirekt caspasaktivering genom att antagonisera de hämmande effekterna på IAPs (Saelens et al., 2004). Således finns det en dynamisk jämvikt mellan pro- och antiapoptotiska effektormolekyler, vilket gör det möjligt för cellen att klara av begränsade mitokondriella skador, i vilket fall IAPs på ett adekvat sätt kan blockera caspasaktivering som initieras av en liten mängd frigjort cytokrom c. Under omständigheter där mitokondriella skador fortskrider eller samtidigt påverkar flera mitokondrier kan dock det antiapoptotiska hinder som IAP:erna utgör övervinnas av den högre cytosoliska koncentrationen av deras antagonister Smac/DIABLO och HtrA2/OMI, som neutraliserar IAP:erna genom direkt bindning.

Det finns allt fler bevis för att cancerceller har en inneboende drivkraft till apoptos som hålls i schack av IAP:erna. I detta syfte har höga basala nivåer av caspase-3- och caspase-8-aktiviteter och aktiva caspase-3-fragment i avsaknad av apoptos påvisats i olika tumörcellinjer och cancervävnader, men inte i normala celler (Yang et al., 2003a). Tumörceller, men inte normala celler, uttryckte också höga nivåer av IAPs, vilket tyder på att uppreglerat IAP-uttryck motverkade den höga basala caspasaktiviteten selektivt i tumörceller (Yang et al., 2003a). Därför anses strategier som är inriktade på IAPs vara en lovande metod för att öka effekten av cytotoxiska terapier selektivt i cancerceller. I detta syfte sänkte transfektionsförstärkt uttryck av Smac/DIABLO tröskeln för TRAIL-inducerad avdödning i olika tumörer (Ng och Bonavida, 2002; Okano et al., 2003) och sensibiliserade även cancerceller för kemoterapi (McNeish et al., 2003; Zhao et al., 2006). Translokation av endogent Smac/DIABLO till cytosolen under cancerläkemedelsinducerad apoptos verkar dock inte spela någon större roll under vissa förhållanden, t.ex. i humana lungkarcinomceller vid behandling med etoposid (Bartling et al., 2004). Nedreglering av Smac/DIABLO med små interfererande RNA (siRNA) påverkade inte dödandet av etoposid i dessa celler, även om en IAP-bindande peptid Smac-N7 ökade den etoposidinducerade apoptosen (Bartling et al., 2004). Dessa data tyder på att Smac/DIABLO-brist kan kompenseras av verkan av redundanta bestämningsfaktorer i vissa cancerceller.

Mitokondriella mediatorer av caspasoberoende apoptos

När HtrA2/OMI frigörs från det mitokondriella intermembranutrymmet bidrar HtrA2/OMI till celldöd även på ett caspasoberoende sätt som proteas förutom att främja apoptos på ett caspasberoende sätt genom att antagonisera IAPs (Suzuki et al, 2001; Martins et al., 2002; van Loo et al., 2002). In vitro-data visade att XIAP, cIAP1, cIAP2 och Apollon bryts ned av proteasaktiviteten hos HtrA2/OMI (Suzuki et al., 2004). Dessutom visade Trencia et al. (2004) att det antiapoptotiska PED/PEA-15 interagerar med och bryts ned av det cytosoliska HtrA2/OMI. Att minska nivåerna av HtrA2/OMI i celler genom antisense eller RNA-interferens minskar olika cancercelllinjers känslighet för celldöd inducerad av staurosporin, Fas, UV eller cisplatin (Martins et al, 2002).

Fortfarande frigörs AIF och endonukleas G från mitokondrier vid permeabilisering av det yttre mitokondriella membranet och translokeras till kärnan för att bidra till kärnkromatinkondensering och storskalig DNA-fragmentering (Cande et al., 2004; Saelens et al., 2004). Huruvida dessa två proteiner frigörs före, tillsammans eller efter cytokrom c har diskuterats kontroversiellt (Arnoult et al., 2002). Dessutom är det fortfarande inte exakt klart hur AIF bidrar till kärn-DNA-fragmentering eftersom det saknar inneboende DNasaktivitet. I däggdjursceller samarbetar cyclophilin A, ett peptidyl-prolyl cis-trans isomeras, med AIF för att inducera nedbrytning av DNA (Cande et al., 2004).

Förstörelse av den intrinsiska banan i cancer

Mutationer i gener som är involverade i regleringen av den mitokondriella banan är mycket vanliga i cancerceller. Eftersom majoriteten av de anti-cancerbehandlingar som inducerar apoptos i cancerceller genom att utlösa den intrinsiska vägen, är sådana mutationer vanligtvis förknippade med behandlingsresistens. Till exempel är överuttryck av Bcl-2, som ett resultat av kromosomal translokation av bcl-2 onkogenen till immunglobulin tunga kedjans genlokus, förknippat med cirka 85 % av humant follikulärt lymfom (Tsujimoto et al., 1984). Försök med transgena möss har visat att överuttryck av Bcl-2 kan främja neoplastisk omvandling av B- och T-lymfocyter och myeloida celler (McDonnell och Korsmeyer, 1991; Traver et al., 1998).

Med tanke på att överuttryck av antiapoptotiska medlemmar av Bcl-2-familjen främjar onkogenes, följer att proapoptotiska medlemmar av denna familj med multi BH-domäner fungerar som tumörsuppressorer. Eftersom Bax och Bak har till stor del överlappande roller i apoptos har det dock varit svårt att avgöra om denna hypotes stämmer, och faktiskt är bax-/- möss inte märkbart predisponerade för neoplasi (Knudson et al., 2001). Somatiska mutationer som inaktiverar bax-genen har dock hittats i vissa solida tumörer och hematologiska maligniteter. För detta ändamål har man beskrivit enstaka nukleotisubstitutioner eller frameshift-mutationer, som inaktiverar Bax-genen i mismatch repair-deficient (MMR) koloncancer eller hematopoetiska maligniteter (Rampino et al., 1997; Kitada et al., 2002).

Det finns dessutom allt fler bevis för att BH3-proteiner kan bidra till att undertrycka malign omvandling, vilket tyder på att de kan fungera som bona fide-tumörsuppressorer. Till exempel visades förlust av en enda allel av Bim påskynda B-cellslymfomagenesen inducerad av uttryck av en c-myc-transgen (Egle et al., 2004), i linje med Bims nyckelroll som regulator av lymfoid homeostas (Strasser, 2005). Intressant nog har homozygota deletioner i den kromosomala region som hyser bim-genen nyligen identifierats hos patienter med mantelcellslymfom (Tagawa et al., 2005). Möss som saknar bid utvecklar spontant en myeloproliferativ sjukdom som kan utvecklas till en malignitet som liknar kronisk myelomonocytisk leukemi (CMML) (Zinkel et al., 2003). Dessutom rapporterades RNAi-medierad suppression av Puma påskynda Myc-inducerad lymfomagenes (Hemann et al., 2004).

Förutom genetiska förändringar regleras avvikande uttryck av Bcl-2-familjens proteiner oftast på transkriptions- eller posttranskriptionell nivå. Till exempel regleras uttrycket av flera antiapoptotiska proteiner ur Bcl-2-familjen, till exempel Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 eller Bfl-1, transkriptionellt av NF-κB (Cory och Adams, 2002).

Bortsett från proteiner ur Bcl-2-familjen har man funnit minskad eller utebliven aktivitet av Apaf-1 i äggstockscancer, melanom och leukemi. Dessutom påverkar mutationer i tumörsuppressorgenen p53, den vanligaste genetiska defekten i mänsklig cancer, den intrinsiska vägen. Till exempel uppreglerar aktivering av p53 ett antal gener som har p53-responsiva element i sina promotorer, t.ex. de proapoptotiska BH3-proteinerna Puma, Noxa och Bid (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Som ett resultat av detta är celler där p53 är stabiliserad känsliga för aktivering av den mitokondriella celldödsvägen. Dessutom kan p53 direkt påverka mitokondriernas integritet utan att det behövs någon genaktivering. Det har faktiskt rapporterats att p53 kan binda till Bcl-2 och Bcl-XL vid mitokondrierna och därigenom främja mitokondriell destabilisering (Mihara et al, 2003).

Signalering via den intrinsiska vägen i cancerterapi

De flesta konventionella kemoterapeutiska medel, t.ex. etoposid, doxorubicin, cisplatin eller paclitaxel, framkallar mitokondriell permeabilisering på ett indirekt sätt genom att utlösa störningar i den intermediära ämnesomsättningen eller genom att öka koncentrationen av proapoptotiska second messengers, t.ex. genom att inducera p53-uttryck, genom att inducera ceramid/GD3-systemet, genom att inducera CD95/CD95L-ligandsystemet, genom att påverka Bcl-2-liknande proteiner och/eller genom att äventyra redox- eller energibalansen.

Det finns allt fler bevis för att det finns en nukleo-mitokondriell korsverkan efter DNA-skador. Till exempel kan apoptotiska signaler som härrör från DNA-skador överföras via tumörsuppressorn p53 till mitokondrier, som i sin tur frigör apoptogena faktorer i cytoplasman som aktiverar nedströms destruktionsprogram (Moll et al., 2005). p53 kan indirekt engagera den mitokondriella banan genom att transkriptionellt aktivera uttrycket av proapoptotiska Bcl-2-proteiner, till exempel Bid, Puma eller Noxa (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). Dessutom kan p53 direkt utlösa permeabilisering av det yttre mitokondriemembranet på ett transkriptionsoberoende sätt genom direkt aktivering av de proapoptotiska Bcl-2-proteinerna Bax eller Bak eller genom att binda och inaktivera antiapoptotiska Bcl-2-proteiner som Bcl-2 eller Bcl-XL (Mihara et al., 2003; Chipuk et al., 2004; Moll et al., 2005). Viktigt är att mitokondriellt riktad p53 nyligen har visat sig ha tumörundertryckande aktiviteter även in vivo (Talos et al., 2005).

För övrigt har caspase-2 förmågan att engagera den mitokondriella apoptotiska vägen som svar på DNA-skador genom att permeabilisera det yttre mitokondriemembranet och/eller genom att bryta cytokrom c:s förening med det inre mitokondriella membranet. Därför var celler som var stabilt transfekterade med procaspase-2 antisense, eller som transient uttryckte siRNA, refraktära mot frisättning av cytokrom c och olika nedströmshändelser, t.ex. caspasaktivering och DNA-fragmentering, som inducerades av DNA-skador (Lassus et al., 2002; Robertson et al., 2002). Caspase-2 kan verka indirekt på mitokondrierna, till exempel genom att klyva det proapoptotiska proteinet Bid, följt av dess translokation till mitokondrierna för att inducera frisättning av cytokrom c (Guo et al., 2002). Dessutom kan caspas-2 direkt permeabilisera det yttre mitokondriemembranet och stimulera frisättningen av cytokrom c och Smac/DIABLO, möjligen som ett resultat av en direkt interaktion mellan bearbetat caspas-2 och putativa proteiner och/eller fosfolipider som är belägna i det yttre mitokondriemembranet, eller vid kontaktställen mellan det yttre och inre membranet (Robertson et al., 2004). Permeabilisering av det yttre mitokondriemembranet kräver bearbetning av caspase-2 zymogenen men inte den associerade proteolytiska aktiviteten och sker oberoende av flera proteiner ur Bcl-2-familjen, inklusive Bax, Bak och Bcl-2 (Robertson et al., 2004). Vidare har caspase-2 också visat sig ha den överraskande förmågan att bryta associationen mellan cytokrom c och anjoniska fosfolipider, särskilt kardiolipin, och därigenom göra ytterligare cytokrom c tillgängligt för frisättning i cytosolen (Enoksson et al., 2004). Vid DNA-skada har caspase-2 nyligen rapporterats aktiveras i den så kallade PIDDosomen, ett komplex av det p53-inducerbara, dödsdomäninnehållande proteinet PIDD, caspase-2 och adaptorproteinet RAIDD (Tinel och Tschopp, 2004), vilket pekar på förekomsten av en nukleo-mitokondriell apoptotisk väg.

Det har dessutom rapporterats att histon H1.2 spelar en viktig roll i överföringen av apoptotiska signaler från kärnan till mitokondrierna efter DNA-dubbelsträngsbrott (Konishi et al, 2003). Histon H1.2 i kärnan frigörs till cytoplasman genom en p53-beroende mekanism efter DNA-dubbelsträngsbrott och inducerade frisättning av cytokrom c från isolerade mitokondrier på ett Bak-beroende sätt (Konishi et al., 2003). En minskning av H1.2-uttrycket ökade den cellulära resistensen mot apoptos inducerad av röntgenstrålning eller etoposid (Konishi et al., 2003).

För övrigt har den orfasta kärnreceptorn Nur77 (även känd som TR3) nyligen kopplats ihop med Bcl-2:s apoptosmaskineri vid mitokondrierna (Lin et al., 2004). Nur77-bindning till Bcl-2:s N-terminala loop-region, som ligger mellan dess BH4- och BH3-domäner, inducerar en konformationsförändring hos Bcl-2 som exponerar dess BH3-domän, vilket resulterar i en omvandling av Bcl-2 från en beskyddare till en mördare (Lin et al., 2004). Intressant nog har förhöjda nivåer av en medlem av Nur77-familjen förknippats med gynnsamma svar på kemoterapeutiska medel hos patienter (Shipp et al., 2002).

Fortfarande, vid cellulär stress, inklusive kemoterapeutiska läkemedel, aktiveras, avtrycks eller induceras specifika proapoptotiska medlemmar av Bcl-2-familjen, och agerar därmed som sensorer. Aktiviteten hos BH3-only-proteiner hålls i schack av flera mekanismer, vilket håller dessa proteiner borta från Bcl-2-multidomänernas motsvarigheter under normala förhållanden, men tillåter ändå deras snabba aktivering under stressförhållanden (Bouillet och Strasser, 2002). Som nämnts ovan står proteiner ur Bcl-2-familjen såsom Bid, Puma eller Noxa under transkriptionell kontroll av tumörsuppressorn p53 och uppregleras därför som svar på DNA-skadande ämnen (Oda et al., 2000; Yu et al., 2001; Sax et al., 2002). BH3-proteinet Bim, som är associerat med cytoskelettet genom att binda till mikrotubuli, frigörs och aktiverar den intrinsiska vägen efter behandling med taxol, som verkar på mikrotubulernas sammansättning (Sunters et al., 2003). Nyligen har paclitaxel visat sig inducera Bim-ackumulering och Bim-beroende apoptos i epiteliala tumörer in vitro och även in vivo (Tan et al., 2005). Aktiva BH3-proteiner binder och motverkar antiapoptotiska och i vissa fall aktiverar multidomäner av proapoptotiska Bcl-2-familjemedlemmar, vilket leder till förlust av mitokondriernas membranpermeabilitet (Bouillet och Strasser, 2002). Hur Bcl-2-proteiner inducerar störningar i mitokondriernas yttre membran är fortfarande föremål för debatt och kan involvera den porbildande och självoligomeriserande kapaciteten hos vissa Bcl-2-familjeproteiner, modulering av mitokondriernas permeabilitetsövergångspor av Bcl-2-familjeproteiner och/eller lipidförändringar och lipidproteininteraktioner inom mitokondriernas membran. Kemoterapeutiska medel som paclitaxel orsakar dessutom hyperfosforylering och inaktivering av Bcl-2 och gynnar samtidigt öppnandet av permeabilitetsövergångsporten (PT) (Ruvolo et al, 2001).

Kemoterapeutiska läkemedel kan också inducera eller underlätta permeabilisering av det yttre mitokondriella membranet genom förändringar i cellulära redoxpotentialer på grund av en ökad generering av reaktiva syrearter (eller en minskning av deras avgiftning), utarmning av reducerat glutation eller utarmning av NADPH, eftersom den mitokondriella megakanalen besitter flera redoxkänsliga platser (Debatin et al., 2002). Dessutom kan förändringar i energimetabolismen, t.ex. minskning av ADP och ATP, underlätta öppnandet av PTPC-komplexet (Permeability Transition Pore Complex), eftersom ADP och ATP är de fysiologiska liganderna för adeninnukleotidtranslokatorn, som fungerar som endogena hämmare av PTPC (Costantini et al., 2000). Dessutom kan frikoppling eller hämning av andningskedjan eller alkalinisering av matrisen gynna permeabilisering av mitokondriernas membran. Dessutom kan lipidböner som ceramid, som genereras i celler som utsätts för flera apoptosinducerande stimuli, inklusive cytotoxiska läkemedel, bidra till mitokondriell membranpermeabilisering (Susin et al., 1997). Vid höga koncentrationer kan vissa kemoterapeutiska läkemedel, t.ex. etoposid eller paclitaxel, också inducera permeabilisering av mitokondriernas yttre membran i isolerade mitokondrier (Robertson et al., 2000; Kidd et al, 2002).

Det har dessutom visat sig att ett ökande antal experimentella cancerläkemedel, däribland arsenit, lonidamid, den syntetiska retinoiden CD437 eller naturprodukten betulinsyra, verkar direkt på mitokondrier (Debatin et al., 2002). Betulinsyra har till exempel rapporterats utlösa apoptos genom att direkt inducera förlust av mitokondriell membranpotential i isolerade mitokondrier på ett sätt som inte påverkas av caspasinhibitorn Z-VAD-fmk och som ändå hämmas av BA, en hämmare av PTPC, eller av Bcl-2 och Bcl-XL (Fulda et al, 1998b).

Strategier riktade mot den intrinsiska vägen

Bcl-2-familjens proteiner

Då antiapoptotiska Bcl-2-proteiner, som potent blockerar den intrinsiska apoptosvägen, hittas i förhöjda halter i humana cancersjukdomar av både hematologiskt och icke-hematologiskt ursprung (Cotter, 2004), utgör de lovande mål för terapeutiska insatser. Följaktligen har flera strategier utvecklats för att rikta in sig på Bcl-2-proteiner, t.ex. antisense-tekniker, BH3-domänpeptider eller syntetiska småmolekylära läkemedel som stör Bcl-2-liknande proteiners funktion. För att minska uttrycket av Bcl-2 utvecklades Bcl-2 antisense-oligonukleotidex (genasense) av Genta Incorporated (Berkeley Heights, NJ, USA). Genasense är en syntetisk, 18-basig, enkelsträngad fosforothioatoligonukleotid som selektivt riktar sig mot de sex första kodonerna (dvs. 18 baser) i den öppna läsramen för mRNA som kodar för Bcl-2-proteinet (Cotter, 2004). Behandling med genasense ökade markant den antitumorala aktiviteten hos många kemoterapeutiska läkemedel, t.ex. taxaner, antracykliner, alkylatorer eller platinainnehållande medel (Cotter, 2004). I en preklinisk modell av melanom ökade förbehandling med genasense kemosensitiviteten hos humant melanom (Jansen et al., 1998). Även i en klinisk prövning rapporterades genasense fungera som kemosensibilisator för dacarbazin hos patienter med malignt melanom (Jansen et al., 2000). För att optimera antisense-baserad terapi utformades därefter bispecifika antisense-oligonukleotider riktade mot en sekvens som är mycket homolog i Bcl-2 och Bcl-xL, men som saknas i Bcl-xS mRNA (Zangemeister-Wittke et al., 2000). Samtidig nedreglering av både Bcl-2 och Bcl-xL inducerade apoptos och ökad kemokänslighet i olika cancerceller (Gautschi et al., 2001; Tortora et al., 2003; Milella et al., 2004; Yamanaka et al., 2005).

Fortsättningsvis utvecklades BH3-domänpeptider eller syntetiska småmolekylära hämmare för att rikta in sig på antiapoptotiska Bcl-2-lika proteiner. BH3-domänen består av en amfipatisk α-helix med nio aminosyror som binder till en hydrofob ficka i Bcl-2-liknande proteiner (Cory och Adams, 2002). På samma sätt syftar BH3-domänpeptider till att störa detta komplex och därigenom göra cancerceller känsliga för apoptosi (Letai et al., 2002). Dessutom resulterade substitution av Bid BH3-domänen med icke-naturliga aminosyror på ytan mittemot den interagerande regionen genom kolvätehäftning i stabiliserade BH3-peptider som kallas SAHBs (stabilized α-helix of Bcl-2 domains), med förbättrade farmakologiska egenskaper (Walensky et al., 2004). Dessa stabiliserade BH3-peptider utlöste apoptos i en mängd olika leukemiska cellinjer och hämmade också tillväxten av leukemi-xenografts i möss utan negativa biverkningar (Walensky et al., 2004).

Det har också identifierats flera småmolekylära föreningar som stör Bcl-2/Bcl-xL-funktionen. Screening av ett kemiskt bibliotek efter föreningar som kan binda till BH3-fickan i Bcl-2-proteiner resulterade i identifiering av HA14-1, en förening som konkurrerar med Bak om bindningen till Bcl-2 (Wang et al., 2000). Genom att screena ett bibliotek med 16 320 förvalda föreningar för förmågan att tränga undan en fluorescerande Bak BH3-peptid från Bcl-xL i en fluorescerande polarisationsanalys identifierade Degterev et al. (2003) två klasser av medel som kallas BH3-hämmare (BH3Is), som också stör Bcl-xL-komplexet med Bax och Bad i intakta celler.

Med hjälp av kärnmagnetisk resonans (NMR)-baserad screening, parallell syntes och strukturbaserad design upptäcktes nyligen en småmolekylär hämmare av de antiapoptotiska proteinerna Bcl-2, Bcl-X(L) och Bcl-w, ABT-737. ABT-737 var effektivt som enskilt medel mot vissa lymfom och solida tumörer och uppvisade synergistisk cytotoxicitet med kemoterapeutika och strålning (Oltersdorf et al., 2005).

Smac/DIABLO-agonister

För utformningen av potentiellt terapeutiska småmolekyler för att rikta in sig på XIAP, har bindningsfåran i XIAP:s BIR3-domän, till vilken Smac/DIABLO binder sig efter att ha frigjorts från mitokondrierna, rönt mest uppmärksamhet. Strukturell analys har gett en tydlig motivering för syntesen av små föreningar som kan efterlikna Smac/DIABLO:s caspas-9-förskjutningsaktivitet från XIAP BIR3 (Chai et al., 2000; Wu et al., 2000). För att förbättra den intracellulära leveransen kopplades Smac-peptiderna till en bärare, t.ex. proteintransduktionsmotivet i HIV Tat-proteinet (Fulda et al., 2002), Drosophila antennapaedia penetratinsekvensen (Arnt et al., 2002) eller en polyargininsträcka (Yang et al., 2003b). En heptapeptid som representerar N-terminus av moget Smac/DIABLO, som är nödvändig för att binda till XIAP, rapporterades främja caspasaktivering och göra olika tumörcellinjer och även primära patienters härledda tumörceller känsliga för apoptos som induceras av dödsreceptorligering eller cytotoxiska läkemedel (Fulda et al., 2002). Viktigt är att Smac-peptiderna till och med förstärkte TRAIL:s antitumöraktivitet in vivo i en intrakraniell xenograftmodell för malignt gliom (Fulda et al., 2002b). På samma sätt kunde en 8-mer peptid (AVPIAQKS) fusionerad med proteintransduktionsdomänen av Drosophila antennapaedia penetratin ta sig in i bröstcancerceller, binda XIAP och cIAP1 och potentiera caspasaktivitet som inducerades av ett antal cancerläkemedel, inklusive paclitaxel, etoposid, 7-etyl-10-hydroxikamptothecin (SN-38) och doxorubicin (Arnt et al., 2002). På grundval av den tredimensionella strukturen av Smac/DIABLO i komplex med XIAP BIR3 utformades dessutom Smac-peptidomimetika som samarbetade med TRAIL, TNFα, cisplatin eller etoposid för att utlösa apoptos i tumörceller (Li et al., 2004; Sun et al., 2004a, 2004b, 2005).

Därefter utvecklades icke-peptidiska småmolekylära antagonister till XIAP, som härrörde från screening av ett fagbibliotek eller ett polyfenylurea-bibliotek, för att rikta in sig på IAP (Schimmer et al., 2004; Wang et al., 2004). Dessutom upptäcktes nyligen naturprodukten embelin från den japanska örten Ardisia som en cellpermeabel, icke-peptidisk, småmolekylär hämmare av XIAP genom strukturbaserad beräkningsmässig screening av en tredimensionell strukturdatabas för traditionell örtmedicin (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Embelin visade sig effektivt övervinna den skyddande effekten av XIAP i prostatacancerceller med höga endogena nivåer av XIAP eller i Jurkatceller transfekterade med XIAP genom att binda till XIAP:s BIR3-domän (Nikolovska-Coleska et al., 2004). Således kan Smac-agonister eller XIAP-antagonister med låg molekylvikt vara lovande kandidater för cancerbehandling genom att potentiera effekten av cytotoxiska terapier selektivt i cancerceller.