Vikten av fixering
För att kunna studera vävnader i mikroskop måste de bevaras (fixeras) och skäras i sektioner som är tillräckligt tunna för att vara genomskinliga. Fixering är ett kritiskt steg i framställningen av histologiska snitt. Om det inte utförs under optimala förhållanden eller om fixeringen fördröjs kan ett vävnadsprov skadas irreversibelt. Oavsett hur mycket omsorg man sedan ägnar sig åt vävnadsbearbetning, mikrotomi och färgning kommer den morfologiska och histokemiska information som kan erhållas från provet att äventyras.
Det breda målet med vävnadsfixering är att bevara celler och vävnadskomponenter i ett ”livliknande tillstånd” eller så lite förändring som möjligt av den levande vävnaden, och att göra detta på ett sådant sätt att det blir möjligt att förbereda tunna, färgade snitt. Valet av fixeringsmedel och fixeringsprotokoll kan bero på de ytterligare bearbetningssteg och slutliga analyser som planeras. Det finns inget perfekt fixeringsmedel, även om formaldehyd kommer närmast. Därför finns det en mängd olika fixeringsmedel att använda, beroende på vilken typ av vävnad som finns och vilka egenskaper som ska påvisas.
Typ av fixering
Fixering av vävnader kan åstadkommas på kemisk eller fysikalisk väg.
Fysikaliska metoder är bland annat uppvärmning, mikrovågning och kryokonservering (frystorkning).
Kemisk fixering uppnås vanligen genom att provet sänks ner i fixeringsmedlet (nedsänkningsfixering) eller, när det gäller smådjur eller vissa hela organ, t.ex. en lunga, genom att kärlsystemet perfuseras med fixeringsmedlet (perfusionsfixering). För vissa specialiserade histokemiska förfaranden har fixeringsmedel ibland använts i form av ånga. Till exempel kan paraformaldehyd och osmiumtetroxid användas för att ångfixera frystorkade vävnader.
- Lär dig mer om Populära fixeringslösningar
Fixeringens mekanism
De två huvudsakliga mekanismerna för kemisk fixering är tvärbindning och koagulering.
Korsbindning innebär att kovalenta bindningar bildas både inom proteiner och mellan dem, vilket gör att vävnaden blir styvare och därmed motståndskraftig mot nedbrytning.
Koagulering orsakas av uttorkning av proteiner genom användning av alkoholer eller aceton. Dessa reagenser avlägsnar och ersätter fritt vatten i celler och vävnader och orsakar en förändring av proteinernas tertiärstruktur genom att destabilisera hydrofoba bindningar. Det kallas också för denaturering.
Faktorer som påverkar fixering
- Temperatur: I allmänhet ökade en temperaturökning fixeringshastigheten, men ökade också hastigheten för autolys och diffusion av cellelement. Traditionellt har 0-4 °C ansetts vara den ideala temperaturen för fixering av prover. Nu utförs fixering rutinmässigt vid rumstemperatur.
- Storlek: 1-4 mm tjocklek
- Volymförhållande: Minst 15-20 gånger större än vävnadsvolymen
- Tid: 24 – 48 timmar
- pH: Bör hållas inom det fysiologiska området, mellan pH 4-9. pH för bevarandet av ultrastrukturen bör buffras mellan 7,2 och 7,4.
Protokoll
- Metoder och protokoll för avkalkning av benmaterial
- Standardprotokoll för formalinfixerad paraffininbäddad vävnad
Användbara länkar
- Fixeringsförfarandet och den Fixeringsmedel
- Populära fixeringslösningar
- Grundläggande introduktion till histologi
- National Society for Histotechnology
- En introduktion till avkalkning
- Praktisk vägledning till god histologisk praxis