Fluorescerande proteiner från A. victoria
Spektraalegenskaperna hos GFP eller dess varianter ligger i den aminosyrastruktur som bildar kromoforen (figur 1). Detta kan vara de tre aminosyrorna på positionerna 65-67 eller rester nära denna plats (t.ex. YFP). Förutom de viktigaste mutationerna som rör kromoforen har forskning även bedrivits om andra platsstyrda mutationer för att förbättra andra faktorer som proteinets mognad och uttryck i heterologa cellsystem (t.ex. kodonanvändning, proteinets veckning vid fysiologisk temperatur). Observera att A. victoria är en relativt primitiv marin organism utan kroppsvärmesystem.
Även om GFP är en av de mest populära FP:erna på grund av dess ljusstyrka och höga fotostabilitet har den två huvudsakliga nackdelar. Dessa är en viss känslighet för pH och en liten tendens till dimerisering. Dimerisering eller oligomerisering är ett problem för många FPs. Deras preferens att agglutinera med varandra kan ge upphov till artefakter eller feltolkningar när det gäller det fusionerade proteinets placering och funktion. Men forskarna kom fram till några svar på det problemet också. Mutationer vid kritiska positioner (F223R, L221K och A206K) där icke-polära aminosyror ersätts med hydrofila aminosyror visar minskad dimerisering. Alla genetiska förändringar som leder till en förbättring av såväl spektrala som praktiska egenskaper sammanfattas under benämningen ”förbättrade” FPs.
I fallet med wtGFP leder förbättringarna till en EGFP (enhanced GFP) med en enda excitationstopp vid 488 nm i stället för det tidigare komplexa absorptionsspektrumet vid 395 nm och 475 nm. Den första muterade versionen av wtGFP (S65T-mutanten) som utvecklades av Roger Tsien et al. var fem gånger ljusare än originalet och visade en kortare mognadstid. Tillsammans med bättre mognadseffektivitet vid 37 °C, baserat på en annan mutation (F64L), spelar detta en viktig roll för personer som tittar på levande celler.
En mycket intressant GFP-variant med en av de största Stokes-förskjutningarna är Sapphire. En mutation i en position nära kromoforen (T203I) leder till en förändring av excitationsmaximum till 399 nm och emissionsmaximum till 511 nm. Detta är en Stokesförskjutning på 112 nm. Emerald är en annan GFP-modifikation med förbättrad fotostabilitet och ljusstyrka samt effektivare veckning i däggdjursceller.
Medan alla gröna fluorescerande proteiner har en relativt hög ljusstyrka lider blå fluorescerande proteiner normalt av minskad emissionsintensitet i mikroskopiska tillämpningar. Trots detta används de i optiska analyser på grund av andra spektrala egenskaper. EBFP (Enhanced Blue Fluorescent Protein) konstruerades genom att mutera wtGFP i flera omgångar. Den första (Y66H) hoppade över emissionstoppen från det gröna till det blå spektrumet. Fler mutationer följde och gav upphov till ett protein med ett excitationsmaximum vid 380 nm och ett emissionsmaximum vid 448 nm. Dessa spektrala egenskaper gör det till en partner för EGFP i FRET-mikroskopi. Nya blå fluorescerande proteiner med högre kvantutbyte och bättre fotostabilitet är Azurite, SBFP2 och EBFP2. En lovande EBFP-efterföljare är ett protein vid namn Sirius som blev populärt på grund av sin mycket höga tolerans mot pH (stabilt från pH 3-9) och sitt rykte om att vara det fluorescerande proteinet med den hittills kortaste emissionsvåglängden.
En andra ”blå” klass av GFP-varianter utgörs av cyanfluorescerande proteiner: CFP. Ersättning av tyrosin med tryptofan (Y66W) och ytterligare genetiska förändringar leder till ett fluorokrom med förbättrad ljusstyrka och fotostabilitet. Denna ECFP har ett bimodalt excitations- och emissionsspektrum vid 433/445 nm och 475/503 nm. Ljusstyrkan är endast cirka 40 % av EGFP:s ljusstyrka. En framträdande ECFP-variant är Cerulean, som har en högre extinktionskoefficient och kvantutbyte. Den är 1,5 gånger ljusare än ECFP och används som FRET-partner med YFP.
En GFP-mutation som inte direkt förändrar en av de tre centrala aminosyrorna i kromoforen resulterade i uppkomsten av gula fluorescerande proteiner. YFP:er har en gemensam treonin i position 203 som byts ut mot en tyrosin (T203Y). Denna aminosyra är en del av β-tunneln och ligger i nära anslutning till kromoforen. Jämfört med GFP har excitations- och emissionsegenskaperna förskjutits till längre våglängder med excitations- och emissionsmaxima vid 514 nm och 527 nm (EYFP). En egenskap hos EYFP är dess pH-känslighet. Vid pH 6,5 har EYFP endast ca 50 % av sin fluorescens, vilket inte alltid är en nackdel. När det gäller pH-mätning (t.ex. av vesiklar, endosomer etc.) kan EYFP användas som indikator. Intressant nog utvecklade en ytterligare mutation (Q69M) en bättre syrastabilitet och dramatiskt förbättrad ljusstyrka (75 % ljusare än EGFP). Detta protein, som fortfarande har en dålig fotostabilitet jämfört med EGFP, kallades Citrine. En annan YFP-mutant (F46L) visade en drastiskt snabbare mognadshastighet och även en förbättrad pH-resistens. Detta protein fick namnet Venus och är en frekvent FRET-acceptor tillsammans med Cerulean.