Braz J Med Biol Res, oktober 2003, Volume 36(10) 1447-1454
Genen för 5-alfa-reduktas typ 1, men inte typ 2, uttrycks i anagena hårstrån som plockats från vertexområdet i hårbotten hos hirsiga kvinnor och normala individer
I.O. Oliveira1,2, C. Lhullier1, I.S. Brum1 och P.M. Spritzer1,3
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
3Unidade de Endocrinologia Ginecológica, Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS, Brasil
Sammanfattning
Sammanfattning 
Syftet med denna studie var att bestämma uttrycket av generna för typ 1 (SDR5A1) och typ 2 (SDR5A2) 5a-reduktas isoenzymer i hårbottenhår som plockats från 33 hirsiga patienter (20 med polycystiskt ovariesyndrom och 13 med idiopatisk hirsutism) och jämföra det med det hos 10 män och 15 normala kvinnor. SDR5A1- och SDR5A2-uttrycket uppskattades genom RT-PCR med hjälp av genen för det ubiquitärt uttryckta proteinet ß2-mikroglobulin som intern kontroll. Resultaten uttrycks som godtyckliga enheter i förhållande till ß2-mikroglobulinets absorbans (medelvärde ± SEM). SDR5A2-uttryck påvisades inte i något hårprov som analyserades i denna studie. Inga skillnader hittades i SDR5A1 mRNA-nivåer mellan män och normala kvinnor (0,78 ± 0,05 respektive 0,74 ± 0,06). SDR5A1-genuttrycket i cellerna i hår som plockats från hårbotten hos normala kvinnor (0,85 ± 0,04) och hos kvinnor med polycystiskt ovariesyndrom (0,78 ± 0,05) och idiopatisk hirsutism (0,80 ± 0,06) var också liknande. Dessa resultat tyder på att SDR5A1-genuttrycket i de follikulära keratinocyterna från vertexområdet i hårbotten inte verkar ha något samband med de skillnader i hårväxt som observerats mellan normala män och kvinnor och hirsutpatienter. Ytterligare studier behövs för att undersöka uttrycket av 5a-reduktasgener i andra follikelkompartment i hårbotten, t.ex. dermal papillae, och även i hårfolliklar från andra platser på kroppen, för att belysa mekanismen för androgenernas inverkan på hårväxtprocessen och relaterade sjukdomar.
Nyckelord: Hårfollikel, Hirsutism, 5a-Reduktas, Polycystiskt ovariesyndrom
Introduktion
Androgener är de viktigaste regleringsfaktorerna för mänsklig hårväxt och är förknippade med en av de viktigaste kliniska hårväxtstörningarna, nämligen hirsutism. Detta tillstånd motsvarar överdriven kroppsbehåring hos kvinnor med ett manligt mönster för fördelningen av kroppsbehåring. Förekomsten av hirsutism kan signalera tillstånd som är förknippade med ökad androgenutsöndring från äggstockar och/eller binjurar, t.ex. polycystiskt ovariesyndrom (PCOS), androgenutsöndrande tumörer och icke-klassisk binjurehyperplasi, eller kan vara ett resultat av perifer överkänslighet mot cirkulerande androgener (idiopatisk hirsutism, IH) (1-3). Även om detta tillstånd i allmänhet inte är livshotande är det mycket plågsamt för patienterna och har en betydande negativ psykosocial påverkan. Att undersöka androgenernas effekter på hårtillväxten i närvaro av hirsutism bör förbättra vår kunskap om människans hårfollikelbiologi.
Effekten av alla aktiva androgener på målceller förmedlas genom att de binder till samma nukleära androgenreceptor. Tidigare studier av androgenresistenssyndrom har avslöjat androgenreceptorns betydelse för androgenberoende hårväxt (4-6). Nyligen observerades en ökad androgenbindningskapacitet i hårceller i hårbotten hos skalliga män (7). Hittills har man dock inte funnit någon konsekvent skillnad i androgenreceptorns antal eller funktion hos hirsute patienter jämfört med normala personer (8,9).
Hårfolliklar har autonom kontroll över androgenmetabolismen och justerar produktionen och nedbrytningen av steroidhormoner i enlighet med de lokala behoven (10). Under normala förhållanden har 5a-reduktas en nyckelroll i androgenernas verkan på hårsäckarna och omvandlar testosteron till den mer potenta androgenen dihydrotestosteron (11,12). Studier av molekylär kloning har karaktäriserat två gener som kodar för isoenzymerna 5a-reduktas typ 1 och typ 2 (13,14). Det 5a-reduktasisoenzym som dominerar i huden är typ 1 (SDR5A1) (15), som har 60 % homologi med 5a-reduktas typ 2 (SDR5A2) som är karakteristiskt för prostatakörteln (14). En ökning av 5a-reduktasaktiviteten har påvisats i fibroblaster i genital- och pubishud från hirsutepatienter i jämförelse med huden hos normala kvinnor (8,16). Dessa studier har rapporterat en ökning av 5a-reduktasaktiviteten även hos IH, som kännetecknas av avsaknad av förhöjda plasmaandrogennivåer (17). Dessutom uttrycker pubishud hos hirsute patienter samma SDR5A1-isoform som pubishud hos normala personer, medan SDR5A2 huvudsakligen uttrycks i genitalhud från både normala personer och hirsute patienter (18). Den fysiologiska rollen för 5a-reduktas isoenzymer är dock inte helt klarlagd och deras fördelning i olika hudkompartment är fortfarande oklar. Vissa immunohistokemiska och enzymaktivitetsstudier har visat på ett dominerande uttryck av SDR5A1-enzymet i talgkörtlar, men även i svettkörtlar, epidermala celler, rotskida och dermala papillaceller från hårsäckar (19-21), medan SDR5A2 endast uttrycks i mycket låga nivåer i dessa kompartment. Däremot har andra studier visat en annan fördelning av dessa isoenzymer inne i pilosebaceus-enheten (22-24). Det verkar finnas en högre fördelning av SDR5A1 i hårfollikelkompartmenten jämfört med SDR5A2. Eftersom keratinocyter i rotskidan visar ett högt uttryck av SDR5A1-genen spelar de dessutom troligen en viktig roll i androgenmetabolismen i hårsäckarna.
Syftet med den här studien var att bedöma uttrycket av SDR5A1- och SDR5A2-generna i cellerna i hårrötans rotskida i vertexområdet av hårbotten från hirsutpatienter och att jämföra det med normala försökspersoner av båda könen.
Patienter och metoder
Subjekt
Studiepopulationen omfattade kvinnor som konsulterade för hirsutism och som setts i följd under en sexmånadersperiod på den gynekologiska endokrinologienheten vid Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasilien. Trettiotre patienter i åldrarna 12-42 år valdes ut för studien. Tjugo patienter fick diagnosen PCOS och 13 patienter fick diagnosen IH. Diagnosen PCOS baserades på de fysiska dragen av hyperandrogenism, störda menstruationscykler, förhöjda nivåer av luteiniserande hormon (LH) i serum eller förhållandet mellan LH och follikelstimulerande hormon, förhöjda nivåer av totalt testosteron och/eller index för fria androgener (FAI), ultraljudsbevis på bilaterala förstorade polykystiska äggstockar (25,26), och avsaknad av ovarie- eller binjureneoplasm eller Cushings syndrom. IH diagnostiserades enligt tidigare beskrivning (27) hos hirsute patienter med regelbundna ägglossningscykler (progesteronnivåer i lutealfasen högre än 3,8 ng/ml), normala androgennivåer och utan någon känd underliggande sjukdom.
Patienter med sent insatt (icke-klassisk) medfödd binjurehyperplasi beaktades inte i studien på grund av en hög plasmanivå av 17-hydroxiprogesteron (>5 ng/ml) och/eller dess markanta ökning efter ACTH-stimulering (>12 ng/ml) (28,29). Patienter med hyperprolaktinemi (serumprolaktinnivåer högre än 20 µg/l vid två olika tillfällen) uteslöts också.
Femton normala kvinnor med regelbundna menstruationscykler i åldern 16-37 år och tio män i åldern 16-29 år valdes också ut för studien, som godkändes av etikkommittén vid Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Informerat samtycke inhämtades från varje försöksperson. Ingen av försökspersonerna hade fått några läkemedel som är kända för att påverka androgen-, östrogen- eller gonadotropin-serumnivåerna under minst tre månader före studien.
SDR5A1- och SDR5A2-mRNA-nivåerna uppskattades med hjälp av omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) i hårceller som plockats från vertex-delen av hårbotten hos normala män, normala kvinnor och hirsutpatienter.
Studieprotokoll
Antropometriska mätningar omfattade kroppsvikt, längd och kroppsmasseindex (BMI = aktuell uppmätt vikt i kg dividerat med höjd i m2). Hirsutismpoäng graderades enligt Ferriman-Gallwey-metoden (30), exklusive områdena underben och underarm.
Hormonell bedömning utfördes mellan dag 2 och 10 i menstruationscykeln eller på någon dag när patienterna var amenorréiska. Efter fastan över natten togs blodprov från en antecubital ven för bestämning av LH, könshormonbindande globulin (SHBG) och totalt testosteron. Alla prover togs mellan 8 och 10 på morgonen. FAI uppskattades genom att dividera totalt testosteron (nmol/l) med SHBG (nmol/l) x 100.
Analyser
Totalt testosteron mättes genom radioimmunoassay med dubbla antikroppar (ICN, Costa Mesa, CA, USA), med en detektionsgräns på 0.04 ng/ml och en varianskoefficient (CV) inom och mellan analyserna på 10 respektive 15 %. SHBG mättes genom en immunokemiluminometrisk analys (ICMA; DPC, Los Angeles, CA, USA) med en detektionsgräns på 0,2 nmol/l och en CV inom och mellan analyserna på 5,0 respektive 8,0 %. LH mättes med ICMA, med en detektionsgräns på 0,7 mIU/ml och en intra- och interassay CV på 5,2 respektive 8,0 %.
RT-PCR-protokoll
Plockade anagena hårstrån samlades in från vertex av hårbotten hos alla försökspersoner och frystes omedelbart i flytande kväve och transporterades till laboratoriet för analyser. Extraktionen av totalt RNA och syntesen av cDNA utfördes enligt tidigare beskrivning (31). De plockade hårrötterna homogeniserades i fenol-guanidinisotiocyanat (Trizol, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA). Totalt RNA extraherades med kloroform och fälldes med isopropanol genom centrifugering med 12 000 g vid 4ºC. RNA-pelleten tvättades två gånger med 75 % etanol, resuspenderades i dietylpyrokarbonatbehandlat vatten och kvantifierades genom absorbans vid 260 nm.
Första strängen cDNA syntetiserades från 5 µg totalt RNA för alla reaktioner med hjälp av SuperScript Preamplification System (Gibco-BRL). Efter denaturering av mall-RNA och primers vid 70ºC i 10 minuter tillsattes omvänt transkriptas i närvaro av 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, plus 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM dNTP-blandning och 10 mM dithiothreitol, och inkuberades vid 42ºC i 55 minuter. Blandningen värmdes till 70ºC för att stoppa reaktionen och inkuberades sedan med E. coli RNas i 20 minuter vid 37ºC för att förstöra otranskriberat RNA. Den mall (cDNA) som användes i de olika PCR-analyserna erhölls från samma reaktion för omvänd transkription. PCR utfördes i en slutvolym på 50 µl. Två mikroliter av den första strängsyntesreaktionen (med ett förväntat cDNA-utbyte på 10 ng) denaturerades vid 94ºC i 3 minuter (2 minuter endast för ß2-mikroglobulin) i närvaro av 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, plus 50 mM KCl och 1,5 mM MgCl2. Efter denna varmstart tillsattes 1,25 U Taq DNA-polymeras tillsammans med samma Tris-HCl-buffert, 1,5 mM MgCl2, 0,4 µM sense- och antisenseprimer och 0,2 mM dNTP-blandning.
Ett 368-bp-fragment av SDR5A1-sekvensen (24) och ett 566-bp-fragment av SDR5A2-sekvensen (14) cDNA amplifierades med hjälp av primers som var utformade för att spänna över intron-exon-gränserna för att förhindra amplifiering av kontaminerande genomiskt DNA. Ett cDNA-fragment på 623 bp som motsvarar det ubiquitärt uttryckta proteinet ß2-mikroglobulin (32) amplifierades för att normalisera cDNA-mängderna i varje prov. cDNA-sekvenserna för SDR5A1 och SDR5A2 och ß2-mikroglobulinprimerna anges i tabell 1. PCR standardiserades genom att testa ett antal cykler (20 till 45) och amplifieringen utfördes i det linjära området. De slutliga PCR-förhållandena var följande: 35 cykler (45 s vid 94ºC, 45 s vid 60ºC, 90 s vid 72ºC, 10 min vid 72ºC) för SDR5A1, 40 cykler (1 min vid 94ºC, 1 min vid 65ºC, 2 min vid 72ºC, 5 min vid 72ºC) för SDR5A2 och 30 cykler (1 min vid 94ºC, 1 min vid 55ºC, 1 min vid 72ºC, 5 min vid 72ºC) för ß2-mikroglobulin. cDNA från dissocierade celler från mänsklig prostata användes som positiv kontroll för alla PCR-reaktioner. Inget cDNA tillsattes till de negativa reaktionerna. Ett prov av PCR-blandningen (15 µl) storleksfraktionerades på 1,5-2,0 % agarosgel färgad med ethidiumbromid, kördes vid 100 V och visualiserades under UV-ljus. De förväntade banden kvantifierades genom densitometrisk analys med hjälp av ett bildbehandlingssystem (ImageMaster VDS, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sverige).
Statistisk analys
Data rapporteras som medelvärde ± SEM, om inget annat anges. Gruppernas medelvärden jämfördes med Student t-test eller med envägs variansanalys (ANOVA) följt av Duncan-testet, och medianvärden jämfördes med Mann-Whitney-testet. Skillnader ansågs vara statistiskt signifikanta vid P < 0,05. Alla analyser utfördes med hjälp av Statistical Packages for the Social Sciences (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).
Resultat
Tabell 2 sammanfattar de antropometriska och hormonella uppgifterna för patienter med PCOS och IH. Inga signifikanta skillnader observerades mellan de två grupperna av hirsutsjuka patienter när det gäller ålder eller klinisk poäng för hirsutism. Hirsute patienter med PCOS uppvisade dock högre BMI och uppvisade signifikant högre nivåer av testosteron, FAI och LH än IH-gruppen. SHBG-koncentrationerna var lägre i PCOS-gruppen än i IH-gruppen.
SDR5A2-genuttryck upptäcktes inte i något hårbottenhårprov som analyserades med RT-PCR i den aktuella studien (figur 1).
Figur 2 visar SDR5A1 mRNA-nivåerna i hårceller som plockats från hårbotten hos normala personer. SDR5A1-uttrycket, presenterat som godtyckliga enheter i förhållande till ß2-mikroglobulinabsorptionen, var liknande hos män (0,78 ± 0,05) och normala kvinnor (0,74 ± 0,06). Vidare observerades inga signifikanta skillnader i follikulära keratinocyters SDR5A1-uttryck mellan normala kvinnor (0,85 ± 0,04) och PCOS- (0,78 ± 0,04) eller IH- (0,80 ± 0,06) hirsutgrupper (figur 3).
|
|
Figur 1. Representativ agarosgel färgad med ethidiumbromid som visar att SDR5A2 mRNA inte uttrycks genom RT-PCR i hårceller som plockats från hårbotten hos män (1-9), normala kvinnor (10-17) och hirsutpatienter: PCOS-gruppen (18-31) och IH-gruppen (32-39). Fragmentet på 566 bp motsvarar SDR5A2 (5a-R2) och fragmentet på 623 bp motsvarar ß2-mikroglobulin (ß2-m). SDR5A2-amplifiering visualiserades endast i dissocierade prostataceller som användes som positiv kontroll (+). |
|
|
Figur 2. Representativ gel som visar SDR5A1 mRNA-nivåer bestämda med RT-PCR i hårceller som plockats från hårbotten hos män (1-7) och normala kvinnor (8-14). Fragmentet på 368 bp motsvarar SDR5A1 (5a-R1) och fragmentet på 623 bp motsvarar ß2-mikroglobulin (ß2-m). RT-PCR-produkterna visualiserades på agarosgel färgad med etidiumbromid. + = positiv kontroll. |
|
|
Figur 3. Representativ gel som visar SDR5A1 mRNA-nivåer bestämda med RT-PCR i hårceller som plockats från hårbotten hos normala kvinnor (1-14) och hos båda grupperna av hirsiga patienter (PCOS: 15-26; IH: 27-35). Fragmentet på 368 bp motsvarar SDR5A1 (5a-R1) och fragmentet på 623 bp motsvarar ß2-mikroglobulin (ß2-m). RT-PCR-produkterna visualiserades på agarosgel färgad med ethidiumbromid. |
Diskussion
Och om hudens 5a-reduktasaktivitet är förknippad med hirsutism måste den specifika rollen och identifieringen av det isoenzym som är involverat i detta kliniska hårväxttillstånd fortfarande definieras bättre. I denna studie undersökte vi mRNA-uttrycket av båda typerna av 5a-reduktas i plockade anagena hårceller i hårbotten hos hirsutsjuka patienter.
Genen SDR5A1 uttrycktes i plockade hårceller som erhållits från vertex av hårbotten hos normala personer. Andra studier har visat liknande resultat, även när SDR5A1 mRNA undersöktes i odlade follikulära keratinocyter (24,33). Plockade anagena hårstrån består huvudsakligen av keratinocytceller som bildar både yttre och inre rotskidor. Bindevävsskidan, den nedre bulben, de dermala papillacellerna och talgkörteln saknas i plockade hårstrån. Våra data bekräftar därför genuttrycket av SDR5A1 i follikulära keratinocyter och stämmer överens med andra, som visat 5a-reduktas immunoreaktivitet i rotskidceller i hårsäckar (20,23).
I den aktuella studien skilde sig inte SDR5A1 mRNA-nivåerna från plockade hårstrån i hårbotten åt mellan normala män och kvinnor. Tidigare studier har också beskrivit en liknande 5a-reduktasaktivitet i hårsäckar från män och kvinnor (12,34). Däremot upptäcktes en högre 5a-reduktasaktivitet i prover av pubishud hos normala män än hos normala kvinnor (1). Sammantaget tyder dessa resultat på att 5a-reduktasregleringen hos normala individer verkar skilja sig åt mellan follikulära keratinocyter i hårbotten och fibroblaster i pubishud.
Hårbottens hårsäcksfollikelceller verkar inte vara huvudmålet för hirsutism. Det finns dock vissa etiska svårigheter med att få prover från ansiktet hos hirsutsjuka patienter. Dessutom finns det endast ett fåtal litteraturrapporter om de molekylära mekanismerna hos hårfollikelcellerna i hårbotten vid hirsutism (9). Hårbotten är en välkänd androgenkänslig plats hos båda könen och det är relativt lätt att få ett prov av hår i hårbotten. Därför är det intressant att undersöka vissa aspekter av androgenmetabolismen i plockade hårceller från hårbotten, särskilt när det är möjligt att jämföra ämnen med en endogen exponering för högre (PCOS) eller normala (IH) cirkulerande androgennivåer.
Vi observerade inga skillnader i SDR5A1 mRNA-nivåerna i de follikulära keratinocyterna vare sig mellan hirsutsjuka patienter och normala kvinnor eller mellan normala män och kvinnor. Dessutom uppvisade patienter med höga serumandrogennivåer (PCOS-gruppen) samma SDR5A1-genuttryck som patienter med IH och normala androgennivåer. Även om SDR5A1 är det isoenzym som dominerar i huden (14), tyder de nuvarande resultaten på att cirkulerande androgener troligen inte bidrar till SDR5A1-genuttrycket i follikulära keratinocyter i hårbotten, vilket tyder på att SDR5A1 inte är det viktigaste isoenzymet i den lokala androgenmetabolismen i hårbottenhuden. Å andra sidan har effekten av 5a-reduktashämmaren finasterid vid behandling av manligt håravfall i mönstret (35) samt vid IH visats (36,37). Finasterid är en oralt aktiv hämmare som företrädesvis blockerar 5a-reduktas typ 2, men som även kan hämma isoenzym typ 1, vilket orsakar en markant minskning av nivåerna av dihydrotestosteron och 3a-androstenediolglukuronid. Det har varken affinitet för androgenreceptorn eller androgena, östrogena, progestationella eller andra steroida effekter (38). I överensstämmelse med våra resultat tyder dessa studier på att 5a-reduktas typ 2 förmodligen har en mer kritisk roll i hårväxtprocessen och relaterade kliniska tillstånd.
De nuvarande resultaten visar att SDR5A2-genen inte uttrycktes i de follikulära keratinocyterna från något ämne, vare sig män eller normala kvinnor eller hirsute patienter. Tidigare studier har beskrivit den preferentiella lokaliseringen av SDR5A2 mRNA och enzymaktivitet (39,40) i dermala papillaceller, även om SDR5A2 immunoreaktivitet också hittades i keratinocyterna i hårfollikeln (20,22). De uppenbara skillnaderna i proteinuttryck mellan dessa studier kan åtminstone delvis förklaras av de olika metoderna för immunohistokemisk analys av kvalitativa data. När det gäller avsaknaden av SDR5A2-genuttryck, som beskrivs i denna studie, kommer känsligare metoder för genuttrycksanalys, t.ex. realtids-PCR, möjligen att klargöra denna fråga i framtiden.
Vi har inte undersökt genuttrycket av 5a-reduktasisoenzymer i andra follikulära kompartment, t.ex. dermala papiller, eftersom dessa celler inte förekommer i plockade isolerade hårstrån. Dermal papillacellerna erhålls endast genom excisionsbiopsi, vilket är en invasiv och påfrestande metod. Det kommer dock att vara mycket intressant att undersöka 5a-reduktasisoenzymer i dermala papillaceller från hirsute patienter, eftersom det har föreslagits att dessa celler kan vara det direkta målet för androgener i hårsäckar och reglera aktiviteten hos hårmatrisen, melanocyter och keratinocyter med parakrina signaler (10).
SDR5A1-genuttryck i follikulära keratinocyter från vertexområdet i hårbotten verkar inte ha något samband med de skillnader i hårväxt som observerats mellan normala män och kvinnor och hirsute patienter. Fler undersökningar om regleringen av 5a-reduktas genuttryck i hårfollikelceller på olika platser i kroppen kan bidra till att belysa den inträngande mekanismen för androgenernas verkan på hårväxtprocessen och associerade sjukdomar.
1. Kuttenn F, Mowszowicz I, Schaison G & Mauvais-Jarvis P (1977). Androgenproduktion och hudmetabolism vid hirsutism. Journal of Endocrinology, 75: 83-91.
2. New MI, Lorenzen F, Lerner AJ et al. (1983). Genotypning av steroid 21 hydroxylasbrist: hormonella referensdata. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 57: 320-326.
3. Azziz R, Carmina E & Sawaya ME (2000). Idiopatisk hirsutism. Endocrine Reviews, 21: 347-362.
4. Mauvais-Jarvis P, Bercovici JP & Gauthier F (1969). Studier in vivo av testosteronmetabolismen i huden hos normala män och patienter med syndromet testikelfeminisering. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 29: 417-421.
5. Griffin JE & Wilson JD (1977). Studier av patogenesen för de ofullständiga formerna av androgenresistens hos mannen. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 45: 1137-1143.
6. Kuttenn F, Mowszowicz I, Wright F, Baudot N, Jaffiol C, Robin M & Mauvais-Jarvis P (1979). Manlig pseudohermafroditism: en jämförande studie av ett fall av 5a-reduktasbrist med tre kompletta former av testikelfeminisering. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 49: 861-865.
7. Hibberts NA, Howell AE & Randall VA (1998). Balding hair follicle dermal papilla cells contain higher levels of androgen receptors than those from non-balding scalp. Journal of Endocrinology, 156: 59-65.
8. Mowszowicz I, Melanitou E, Doukani A, Wright F, Kuttenn F & Mauvais-Jarvis P (1983). Androgenbindningskapacitet och 5-reduktasaktivitet i fibroblaster i pubishud från hirsute patienter. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 56: 1209-1213.
9. Oliveira IO, Lhullier C, Brum IS & Spritzer PM (2003). Genuttryck av 17ß-hydroxysteroiddehydrogenas av typ 2 i hårbottenhår hos hirsute kvinnor. Steroids (i tryck).
10. Randall VA (1994). Androgener och mänsklig hårväxt. Clinical Endocrinology, 40: 439-457.
11. Hay JB & Hodgins MB (1973). Metabolism av androgener in vitro av mänsklig ansikts- och axillär hud. Journal of Endocrinology, 59: 475-486.
12. Takayasu S, Wakimoto H, Itami S & Sano S (1980). Aktivitet av testosteron 5a-reduktas i olika vävnader av mänsklig hud. Journal of Investigative Dermatology, 74: 187-191.
13. Andersson S, Bischop RW & Russell DW (1989). Uttryck, kloning och reglering av steroid 5a-reduktas, ett enzym som är viktigt för manlig sexuell differentiering. Journal of Biological Chemistry, 264: 16249-16255.
14. Andersson S, Berman DM, Jenkins EP & Russell DW (1991). Deletion av genen för steroid 5a-reduktas 2 vid manlig pseudohermafroditism. Nature, 354: 159-161.
15. Harris G, Azzolina B, Baginsky W, Cimis G, Rasmusson G, Tolman R, Raetz C & Ellsworth K (1992). Identifiering och selektiv hämning av en isoenzym av steroid 5a-reduktas i mänsklig hårbotten. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 89: 10787-10791.
16. Lobo RA, Goebelsmann U & Horton R (1983). Bevis för betydelsen av perifera vävnadshändelser i utvecklingen av hirsutism vid polycystiskt ovariesyndrom. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 57: 393-397.
17. Serafini P & Lobo RA (1985). Ökad 5-reduktasaktivitet vid idiopatisk hirsutism. Fertility and Sterility, 43: 74-78.
18. Mestayer CH, Berthaut I, Portois M-C, Wright F, Kuttenn F, Mowszowicz I & Mauvais-Jarvis P (1996). Dominant uttryck av 5a-reduktas typ 1 i pubishud från normala personer och hirsutpatienter. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 81: 1989-1993.
19. Luu-The V, Sugimoto Y, Puy L, Labrie Y, Solache IL, Singh M & Labrie F (1994). Karaktärisering, uttryck och immunohistokemisk lokalisering av 5a-reduktas i mänsklig hud. Journal of Investigative Dermatology, 102: 221-226.
20. Eicheler W, Dreher M, Hoffmann R, Happle R & Aumüller G (1995). Immunohistokemiska bevis för differentiell fördelning av isoenzymer av 5a-reduktas i mänsklig hud. British Journal of Dermatology, 133: 371-376.
21. Chen W, Zouboulis CC, Fritsch M, Blume-Peytavi U, Kodelja V, Goerdt S, Luu-The V & Orfanos CE (1998). Bevis för heterogenitet och kvantitativa skillnader i uttrycket av typ 1 5a-reduktas i odlade mänskliga hudceller: bevis för dess närvaro i melanocyter. Journal of Investigative Dermatology, 110: 84-89.
22. Bayne EK, Flanagan J, Einstein M et al. (1999). Immunohistokemisk lokalisering av typ 1 och 2 5a-reduktas i mänsklig hårbotten. British Journal of Dermatology, 141: 481-491.
23. Sawaya ME & Price VH (1997). Olika nivåer av 5a-reduktas typ I och II, aromatas och androgenreceptor i hårsäckar hos kvinnor och män med androgenetisk alopeci. Journal of Investigative Dermatology, 109: 296-300.
24. Courchay G, Boyera N, Bernard BA & Mahe Y (1996). Messenger RNA-uttryck av subtyper av steroidogenesenzymer i den mänskliga pilosebaceous enheten. Skin Pharmacology, 9: 169-176.
25. Adams J, Franks S, Polson DW, Mason HD, Abdulwahid N, Tucker M, Morris DV, Price J & Jacobs HC (1985). Multifollikulära äggstockar: kliniska och endokrina egenskaper och svar på pulserande gonadotropinfrisättande hormon. Lancet, 2: 1375-1379.
26. Herter LD, Magalhães JA & Spritzer PM (1996). Relevans av bestämning av ovarievolym hos tonårsflickor med menstruationsstörningar. Journal of Clinical Ultrasound, 24: 243-248.
27. Spritzer PM, Oppermann-Lisboa K, Mattiello S & Lhullier F (2000). Användning av spironolakton som ett enda medel för långtidsbehandling av hirsutande patienter. Clinical Endocrinology, 52: 587-594.
28. Spritzer PM, Billaud L, Thalabard J, Kuttenn F & Mauvais-Jarvis P (1990). Cyproteronacetat jämfört med hydrokortisonbehandling vid sent uppkommen binjurehyperplasi. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 70: 642-645.
29. Azziz R, Dewailly D & Owerbach D (1994). Icke-klassisk binjurehyperplasi: aktuella begrepp. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 78: 810-815.
30. Ferriman D & Gallwey JD (1961). Klinisk bedömning av kroppshårstillväxt hos kvinnor. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 21: 1140-1148.
31. Reis FM, Maia AL, Ribeiro MFM & Spritzer PM (1999). Gestagenmodulation av c-fos- och prolaktin-genuttryck i det mänskliga endometriet. Fertility and Sterility, 71: 1125-1132.
32. Taplin ME, Bubley GJ, Shuster TD, Frantz ME, Spooner AE, Ogata GK, Keer HN & Balk SP (1995). Mutation av androgenreceptorgenen vid metastatisk androgenoberoende prostatacancer. New England Journal of Medicine, 332: 1393-1398.
33. Eicheler W, Huth A, Happle R & Hoffmann R (1996). RNA-nivåer av 5a-reduktas och androgenreceptor i mänsklig hud, hårsäckar och follikelavledda celler. In: Van Neste DJJ & Randall VA (redaktörer), Hair Research for the Next Millenium. Elsevier Science, Amsterdam, 327-331.
34. Schweikert HU & Wilson JD (1974). Reglering av mänsklig hårväxt med hjälp av steroidhormoner. I. Testosteronmetabolism i isolerade hårstrån. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 38: 811-819.
35. Kaufman KD, Olsen EA, Whiting D et al. (1998). Finasterid vid behandling av män med androgenetisk alopeci. Finasteride Male Pattern Hair Loss Study Group. Journal of the American Academy of Dermatology, 39: 578-589.
36. Tartagni M, Schonauer LM, De Salvia MA, Cicinelli E, De Pergola G & D’Addario V (2000). Jämförelse av Diane 35 och Diane 35 plus finasterid vid behandling av hirsutism. Fertility and Sterility, 73: 718-723.
37. Sahin Y, Diller S & Kelestimur F (2001). Jämförelse av Diane 35 och Diane 35 plus finasterid vid behandling av hirsutism. Fertilitet och sterilitet, 75: 496-500.
38. Rittmaster RS (1994). Finasteride. New England Journal of Medicine, 330: 120-125.
39. Asada Y, Sonoda T, Ojiro M, Kurata S, Sato T, Ezaki T & Takayasu S (2001). 5a-Reduktas typ 2 uttrycks konstitutivt i dermal papilla och bindvävsskida i hårfollikeln in vivo men inte under odling in vitro. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 86: 2875-2880.
40. Eicheler W, Happle R & Hoffmann R (1998). 5a-Reduktasaktivitet i den mänskliga hårfollikeln koncentreras i den dermala papillen. Archives of Dermatological Research, 290: 126-132.