Konvertering av mRNA till dubbelsträngat cDNA

Enzymatisk konvertering av mRNA till dubbelsträngat insatt DNA kan åstadkommas genom ett antal olika förfaranden. Samtliga inbegriper verkan av omvänt transkriptas och oligonukleotidprimat syntes av cDNA. Därefter skiljer sig de allmänt använda förfarandena avsevärt åt. Det finns ett antal metoder för att syntetisera den andra strängen och flera förfaranden för att producera lämpliga ändar för att göra klonbart DNA. De viktigaste målen för dessa förfaranden är att konstruera insatt DNA som är så långt som möjligt, med ett högt utbyte av omvandling av mRNA till DNA som kan ligera till vektor-DNA. Följande protokoll kräver endast kommersiellt tillgängliga reagenser och är vanligtvis framgångsrika när det gäller att producera bra cDNA-bibliotek. Grundprotokollet beskriver en metod för att framställa cDNA med trubbiga ändar som sedan kan ligeras till länkare för efterföljande kloning i en unik restriktionsplats, t.ex. EcoRI. Det alternativa protokollet är en variant som kräver färre enzymatiska manipulationer och som gör det möjligt att bygga riktade cDNA-bibliotek, vilket är särskilt önskvärt när målet är att generera expressions-cDNA-bibliotek. Det alternativa protokollet utnyttjar en länk-primer som består av (i ordning från 3′ till 5′) en oligo(dT)-primer, en restriktionsplats för XhoI-endonukleaset och en upprepning av (GA)20 för att skydda restriktionsplatsen under genereringen av cDNA med trubbiga ändar. De interna XhoI-platserna på de enskilda cDNA-molekylerna skyddas genom inkorporering av 5-metyl-dCTP i den första strängens nukleotidblandning. De resulterande cDNA:erna med unika ändar kan klonas in i EcoRI/XhoI-digrerade vektorer efter ligering av EcoRI-adaptrar till 5′-ändan och digestion med XhoI för att frigöra de 3′-XhoI-platser som införlivats i cDNA:n med hjälp av linkern-primern. Dessa ändringar resulterar i ett avsevärt effektiviserat förfarande som är betydligt snabbare och enklare än grundprotokollet.